亞洲玉米螟GSTs RNAi干擾載體構(gòu)建及功能研究.pdf

1、亞洲玉米螟是我國重要的糧食害蟲之一，分布廣且危害嚴重。亞洲玉米螟嚴重危害我國玉米產(chǎn)量和品質(zhì)。目前對于亞洲玉米螟的化學防治和生物防治面領著亞洲玉米螟不斷產(chǎn)生抗藥性的制約。因此。探尋新的亞洲玉米螟生物防治途徑已成為急需解決的問題。
　　 在本實驗中，我們以亞洲玉米螟三齡幼蟲對茉莉酸甲酯誘導玉米抗性的取食相應過稱為研究對象。構(gòu)建了此過程中的亞洲玉米螟中腸cDNA文庫。并結(jié)合測序結(jié)果與歐洲玉米螟EST序列構(gòu)建了玉米螟unigenes數(shù)據(jù)

2、庫。從unigenes數(shù)據(jù)庫中選取了13個基因片段進行克隆，結(jié)果表明:其中12個基因片段被成功克隆。同時我們對此過程中亞洲玉米螟幼蟲中腸進行了定量蛋白質(zhì)自學研究。在中腸中發(fā)現(xiàn)了42個差異表達蛋白，其中上調(diào)蛋白上調(diào)蛋白26個，下調(diào)蛋白16個;在內(nèi)含物中共發(fā)現(xiàn)了19個差異表達蛋白，其中上調(diào)蛋白7個，下調(diào)蛋白12個。同時我們還發(fā)現(xiàn)了19個蛋白，這19個蛋白在不同的處理條件下，在中腸和內(nèi)含物中的含量比例不同。對這些蛋白的功能分析表明:這些差異表

3、達蛋白具有不同的功能。這暗示了:亞洲玉米螟的取食相應過程是一個多蛋白多網(wǎng)絡的響應過程。與此同時我們結(jié)合了unigenes數(shù)據(jù)庫對部分編碼差異表達蛋白基因片段進行克隆。為今后的研究奠定了基礎。
　　 谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)是昆蟲體內(nèi)一類重要的解毒酶系。在昆蟲抗逆響應中具有重要作用。本實驗通過使用家蠶GST蛋白序列在unigenes數(shù)據(jù)庫中進行本地blast比對。預測了8條亞洲玉米螟GST相關(guān)蛋白編碼基因片段。并成功克隆了其

4、中的6條。分別命名為:OfGSTd3，OfGSTd2，OfGSTe1，OfGSTo1，OfGSTo4,OfGSTe2，，OfGSTs1，OfGST-GP。通過結(jié)合不同的比對序列構(gòu)建亞洲玉米螟GSTs系統(tǒng)進化樹，結(jié)果表明除OfGSTd2外其余的GSTs相關(guān)蛋白均可明確的進行家族分類。之后，采用RT-PCR，我們探索了個GST基因在各齡幼蟲中的表達情況的變化。同時，結(jié)合本實驗室的先前研究，我們探索了我們已有的亞洲玉米螟GST相關(guān)基因在亞洲玉

5、米螟三齡幼蟲取食響應中表達情況的變化。之后，使用QRT-PCR和WesternBlot技術(shù)探索玉米內(nèi)生殺蟲物質(zhì)丁布對本實驗室先前發(fā)現(xiàn)的亞洲玉米螟OfGSTd1基因的誘導表達作用;并通過構(gòu)建RNAi干擾工程菌株。并使用丁布丁布飼喂試驗驗證RNAi工程菌的功能。相應實驗結(jié)果表明:在丁布誘導可導致亞洲玉米螟OfGSTd1表達水平升高;干擾OfGSTd1后亞洲玉米螟對丁布的解毒能力減弱。這表明:亞洲玉米螟OfGSTD1蛋白可能參與亞洲玉米螟對丁