原油降解真菌分離和降解及芳香烴降解基因的轉(zhuǎn)錄譜分析.pdf

1、石油作為能源被廣泛利用，但在石油開(kāi)采、運(yùn)輸及生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)土壤環(huán)境產(chǎn)生的污染也是嚴(yán)重困擾人類的問(wèn)題。污油的處理方法很多，包括物理、化學(xué)和生物等修復(fù)方法，其中生物修復(fù)以安全、經(jīng)濟(jì)，無(wú)二次污染等優(yōu)點(diǎn)備受關(guān)注。但原油中組分復(fù)雜，污染土壤的生物修復(fù)難度也很大，尤其是石油中的芳香烴類成分更難被微生物所利用，因此，分離篩選原油降解微生物，研究其對(duì)原油組分的代謝特點(diǎn)，并采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)探討原油降解真菌的芳香烴降解相關(guān)基因表達(dá)，為今后芳香烴高效降解菌的

2、篩選和開(kāi)發(fā)提供技術(shù)支持，從而進(jìn)一步提高原油污染的生物修復(fù)效率。
　　本研究從大慶油田地區(qū)長(zhǎng)期油污土壤中分離得到了12株高效的原油降解真菌，通過(guò)菌落形態(tài)、菌絲形態(tài)、生理生化實(shí)驗(yàn)及ITS序列對(duì)已分離真菌進(jìn)行了鑒定，確定其近緣種屬:H1、H3、H9、X9與X12屬于鐮刀菌屬（Fusarium sp.）; H2屬于土曲霉(Aspergillus terreus)，H4屬于雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)，X1屬于植物

3、內(nèi)生菌（Fungal endophyte），X3屬于真菌菌株（Fungal sp.），X7屬于黃白生叢赤殼菌（Bionectria ochroleuca），X11屬于葡萄穗酶菌（Stachybotrys sp.），D4屬于木霉菌(Trichoderma atroviride)。
　　在液體培養(yǎng)條件下研究了pH、氮源和磷源對(duì)12種真菌菌絲干重的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)12種原油降解真菌均在pH7.0時(shí)生長(zhǎng)旺盛，獲得較高的菌絲干重，H9和X12

4、真菌在以NH4NO3為氮源時(shí)生物量最高，H4真菌的最適氮源為NaNO3，其余9種原油降解真菌均以KNO3為氮源時(shí)達(dá)到最大平均菌絲干重。KH2PO4和K2HPO4/KH2PO4(1∶2)雙磷源都能使12種真菌具有較高的生物量，且兩種磷源對(duì)菌絲生長(zhǎng)影響不顯著。
　　影響真菌原油降解率的因素有很多，本文主要探討了培養(yǎng)條件、pH、N/P比值、NaCl濃度和原油濃度對(duì)12種原油降解真菌原油降解率的影響?？傮w來(lái)說(shuō)，當(dāng)pH、N/P比值、NaCl

5、濃度確定時(shí)，真菌在液體培養(yǎng)條件下的原油降解率普遍高于土壤中的原油降解率。在pH7.0時(shí)多數(shù)真菌表現(xiàn)為最高降解率，在pH8.0～9.0時(shí)真菌也能維持較高的降解率。同時(shí)12種真菌的原油降解率隨NaCl濃度的升高而降低，但NaCl濃度為10％時(shí)X9和D4菌株還有20％以上的原油降解率，可以看出從大慶油污土壤中分離的原油降解真菌具有一定的耐鹽堿性，這與菌種對(duì)大慶地區(qū)的鹽堿土壤特質(zhì)的適應(yīng)性是相符的。12種真菌菌株中X1菌株在液體培養(yǎng)和土壤培養(yǎng)中都

6、顯示出了最高的原油降解率。
　　真菌對(duì)石油烴類物質(zhì)的降解代謝多數(shù)是從單加氧開(kāi)始的，但在代謝過(guò)程中不同的菌種有多種復(fù)雜的酶系參與，本文對(duì)12種原油降解真菌在1％原油濃度下幾種主要降解相關(guān)氧化還原酶活性進(jìn)行研究，探討真菌在原油降解過(guò)程中木質(zhì)素過(guò)氧化物酶(LiginPeroxidase，LiP)、錳過(guò)氧化物酶(Manganese Peroxidase，MnP)和漆酶(Laccases，Lac)活力與原油降解率之間的關(guān)系。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各菌株

7、產(chǎn)酶種類和活力各不相同，除X12的LiP和H4的Lac的活性受原油的抑制外其余菌株的酶活性都能夠在原油的誘導(dǎo)下顯著升高。Lac的活性與真菌土壤條件原油降解率呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)性;LiP活性與液體和土壤培養(yǎng)條件下原油降解率之間的相關(guān)系數(shù)均小于0.3;而MnP活性與原油降解率之間呈現(xiàn)負(fù)相關(guān)。
　　通過(guò)對(duì)能夠降解芳香烴的X1菌株的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序、過(guò)濾和拼接后得到了34003個(gè)轉(zhuǎn)錄本，即Unigene，并在Nt、Nr、GO等7個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)中成功注釋

8、了28660個(gè)基因片段。GO分類顯示與烷烴代謝相關(guān)的酶基因共16376個(gè)，其中在GO功能注釋中功能為氧化還原酶作用于CH-CH、氧化還原酶作用于雙酚及相關(guān)物質(zhì)、氧化還原酶作用于CH-OH、轉(zhuǎn)移酶作用于?；⑥D(zhuǎn)移酶作用于烷基或芳基、碳-碳裂解的酶基因數(shù)量都相對(duì)較多。KEGG Pathway富集結(jié)果顯示X1菌株的基因集中在碳水化合物代謝途徑中的最多，有527個(gè)，占被注釋的基因總數(shù)的12.3％，并且其中細(xì)胞芳香化合物代謝和雜環(huán)代謝途徑中的基因