勞爾氏菌降解木質(zhì)素通用成分G單元相關(guān)基因的功能研究.pdf

1、木質(zhì)素是含有氧代苯丙醇或其衍生物結(jié)構(gòu)單元的芳香性天然有機(jī)高分子化合物，是世界上儲(chǔ)量?jī)H次于纖維素含量的有機(jī)生物質(zhì)。木質(zhì)素可再生，雖能大量提供可再生芳基化合物，但難于生物降解，限制了木質(zhì)素的應(yīng)用前景和價(jià)值。木質(zhì)素生物降解在自然界有機(jī)碳素的生物地球化學(xué)循環(huán)中起關(guān)鍵作用，是決定碳循環(huán)的限速步驟。愈創(chuàng)木基結(jié)構(gòu)（又稱木質(zhì)素G單元）是木質(zhì)素中唯一一種在所有木素質(zhì)中都普遍存在的通用構(gòu)成單元，它的降解機(jī)制基本上代表了所有木質(zhì)素的降解途徑，研究G單元的生物

2、降解對(duì)木質(zhì)素的降解具有非常重要的現(xiàn)實(shí)意義，也對(duì)木質(zhì)素來(lái)源的芳香族化合物（如造紙廠黑液）污染治理有著重要的作用。其中，木質(zhì)素G單元系列化合物中代表化合物阿魏酸及其結(jié)構(gòu)類似物羥基肉桂酸具有普遍研究關(guān)注度。因此，本研究以阿魏酸及其結(jié)構(gòu)類似物為底物，研究勞爾氏菌對(duì)其的生物降解。勞爾氏菌是一種革蘭氏陰性細(xì)菌，可破壞植物細(xì)胞壁組織進(jìn)入木質(zhì)部導(dǎo)管而致病，因而可能降解木質(zhì)素成分。根據(jù)勞爾氏菌基因組信息，我們發(fā)現(xiàn)其rsp0221-rsp0228基因可能和

3、阿魏酸的降解相關(guān)，rsp0221為二組分反應(yīng)調(diào)節(jié)子，在勞爾氏菌對(duì)外界反應(yīng)過(guò)程中起作用;rsp0222和rsp0223編碼O型香草酸脫甲基酶和O型脫甲基氧亞基氧化還原酶，負(fù)責(zé)將香草酸降解到原兒茶酸;rsp0225編碼肉桂酰輔酶A水解酶，負(fù)責(zé)肉桂酰輔酶A的脫氫反應(yīng)，生成醛類物質(zhì);rsp0226編碼醛脫氫酶，將醛代謝到酸;rsp0227基因編碼肉桂酰輔酶A合成酶，負(fù)責(zé)對(duì)羥基肉桂酸的酰化;另外，Rsc1285可能影響Ⅲ型分泌系統(tǒng)對(duì)植物導(dǎo)管的侵入

4、。因此，本研究通過(guò)基因敲除和功能互補(bǔ)等技術(shù)構(gòu)建上述相關(guān)基因突變體，研究其對(duì)木質(zhì)素G單元（阿魏酸等）的生物降解及相關(guān)基因的功能作用。
　　本研究成功構(gòu)建了勞爾氏菌sp0221基因和rsp0227基因缺失的突變菌株。研究發(fā)現(xiàn)，高濃度的阿魏酸對(duì)勞爾氏菌的生長(zhǎng)有明顯抑制作用，而0.5g/L阿魏酸的添加對(duì)勞爾氏菌生長(zhǎng)沒(méi)有影響，且在該濃度范圍下，勞爾氏菌可利用阿魏酸為唯一碳源生長(zhǎng)。rsp0227基因缺失，使得其無(wú)法利用羥基肉桂酸為唯一碳源生長(zhǎng)

5、，但可利用羥基肉桂酸代謝下游產(chǎn)物為唯一碳源生長(zhǎng)，rsp0227基因互補(bǔ)菌株可以把rsp0227基因缺失突變體利用羥基肉桂酸為唯一碳源生長(zhǎng)的能力恢復(fù)到野生型水平。表明Rsp0227負(fù)責(zé)勞爾氏菌對(duì)羥基肉桂酸的直接降解，即負(fù)責(zé)肉桂酰輔酶A的合成。rsp0221基因的缺失，并不影響勞爾氏菌利用羥基肉桂酸為唯一碳源的生長(zhǎng)，表明Rsp0221可能和羥基肉桂酸的降解不直接相關(guān)。在對(duì)阿魏酸降解時(shí)，勞爾氏菌野生型和rsp0221基因缺失突變體在1天后可降

6、解高達(dá)90％的阿魏酸，而rsp0227基因缺失突變體喪失了對(duì)阿魏酸的降解能力。此外，勞爾氏菌的Ⅲ型分泌系統(tǒng)在其侵入植物導(dǎo)管的過(guò)程中起主要作用，能將一些效應(yīng)蛋白注入到植物細(xì)胞內(nèi)。因此，我們研究了阿魏酸對(duì)Ⅲ型分泌系統(tǒng)表達(dá)的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，阿魏酸的添加明顯促進(jìn)了勞爾氏菌野生型、rsp0221、rsp0227基因缺失突變體中Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因的表達(dá)水平（提高2-3倍），表明阿魏酸可能促進(jìn)了勞爾氏菌對(duì)植物細(xì)胞破壞、侵入過(guò)程。當(dāng)rsc1285基因缺失

7、時(shí)，勞爾氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)的表達(dá)水平明顯降低了1/2，而rsc1285基因互補(bǔ)可以把其Ⅲ型分泌系統(tǒng)的表達(dá)水平恢復(fù)到野生型表達(dá)水平，表明Rsc1285是影響勞爾氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)表達(dá)的一個(gè)因子。勞爾氏菌Ⅲ型分泌系統(tǒng)受到HrpB的直接控制，而hrpB的表達(dá)受到HrpG、PrhG的共同調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，Rsc1285通過(guò)HrpB控制Ⅲ型分泌系統(tǒng)基因的表達(dá)，但和HrpB上游調(diào)控因子HrpG、PrhG無(wú)關(guān)。在侵染番茄植株時(shí)，rsc1285基因缺失突變