維生素D和Ca2+誘導腎結石形成及其生物學機制研究.pdf

1、本文分為以下幾個部分進行探討：
　　第一部分 血維生素D與上尿路結石的相關性：系統(tǒng)評價與薈萃分析
　　背景和目的：當前有眾多研究比較了結石和非結石患者血清/血漿1,25(OH)2D3和25(OH)D水平，但是它們的結果并不一致，甚至相互矛盾。因而我們開展了這項研究以便系統(tǒng)地比較結石和非結石患者血維生素D水平的差異。
　　方法：系統(tǒng)檢索PubMed，Web of Science，Cochrane圖書館，中國知網(wǎng)和萬方數(shù)據(jù)

2、庫，篩選納入文獻，并進行Meta分析。
　　結果：最終本研究共納入包含有23228名參與者的32項研究。Meta分析結果表明，相較于非結石對照者，結石患者和含鈣結石患者血1,25(OH)2D3水平顯著升高（加權均數(shù)差 WMD,10.19pg/ml;95％CI,4.31-16.07; p=0.0007和 WMD,11.28pg/ml;95%CI,4.07-18.50; p=0.002），但血25(OH)D水平相近（ WMD,0.88

3、ng/ml;95%CI,-1.04-2.80; p=0.37和 WMD,-0.63ng/ml;95%CI,-2.72-1.47;p=0.56）。與對照組和尿鈣正常結石患者相比，高鈣尿結石患者血1,25(OH)2D3升高（WMD,9.41pg/ml;95%CI,0.15-18.67;p=0.05 and WMD,2.75pg/ml;95%CI,-0.20-5.69;p=0.07）并伴隨25(OH)D血濃度升高（WMD,5.02ng/ml;

4、95%CI,0.99-9.06;p=0.01和WMD,5.02ng/ml;95%CI,2.14-7.90;p=0.0006）。與非結石患者相比，尿鈣正常結石患者血1,25(OH)2D3水平升高（WMD,6.85pg/ml;95%CI,-5.00-18.71;p=0.26）但無統(tǒng)計學差異，且兩者血25(OH)D濃度相近（WMD,0.94ng/ml;95%CI,-3.55-5.43;p=0.68）。進一步行敏感性分析得出與上述結果相似的結果

5、。結論：目前的證據(jù)表明血1,25(OH)2D3增加與泌尿結石相關，而血25(OH)D升高僅與高鈣尿結石顯著相關。尚需進一步研究確認上述結果并闡明維生素 D在結石發(fā)病機制中的作用。
　　第二部分 基于維生素D通路激活構建高鈣尿結石大鼠模型
　　背景和目的：目前結石動物模型以高草酸尿動物模型為主，高鈣尿結石動物模型較少。經(jīng)典的遺傳性高鈣尿結石大鼠模型和一些可形成腎間質鈣化的基因敲除小鼠存在培育復雜和價格高昂的局限。相關研究顯示這

6、些動物模型普遍存在維生素D通路激活的特點，并且我們先前的研究也證實結石病人存在血活性維生素D水平增高。因而我們擬通過單純給予 Sprague-Dawley大鼠活性維生素 D，嘗試建立一種相對簡便、經(jīng)濟、可重復的高鈣尿結石動物模型。
　　方法：取6周齡雄性Sprague-Dawley大鼠，隨機分為維生素D造模組（24只）、對照組（18只）和乙醛酸造模組（6只），正常飲食和飲水。維生素D造模組按100ng/100g體重隔日腹腔注射2n

7、g/ul的1,25(OH)2D3溶液。在第2、4、8和12周時測量體重并測定24小時尿鈣。在第4周、8周和12周隨機處死8只大鼠，取血測定血鈣、血磷和肝腎功能等指標。留取腎臟，行HE和Von Kossa染色觀察顯微結構以及鈣鹽沉積和結石形成情況，行掃描電鏡觀察超微結構，行micro CT平掃和三維重建整體觀察腎臟鈣鹽沉積和結石形成情況。對照組大鼠除隔日腹腔注射對應劑量溶劑和定期處死6只大鼠外，其余處理和檢測指標與維生素 D造模組相同。乙

8、醛酸造模組大鼠按照10mg/100g體重每日腹腔注射乙醛酸溶液，連續(xù)注射10天。10天后處死取腎臟行HE和Von Kossa染色觀察其顯微結構以及及鈣鹽沉積和結石形成情況，并與維生素D造模組比較鈣鹽沉積的分布。
　　結果：維生素D造模組大鼠體重在第4至12周時顯著低于對照組大鼠，肝功能和腎功能指標在各周與對照組無明顯差異。維生素 D組大鼠血鈣在各個時間點均顯著高于對照組，而血磷僅在第4周低于對照組。維生素 D組尿鈣濃度以及24小時

9、尿鈣均顯著高于對照組。維生素D造模組大鼠在第4周時，在micro CT上偶見腎實質鈣鹽沉積；在第8周時，石蠟切片Von Kossa染色在腎內層髓質腎乳頭部位可見明顯鈣鹽沉積，腎盂可見結石形成，micro CT可見明顯腎實質鈣化和結石形成；在第12周時，鈣化程度進一步加重。行掃描電鏡觀察見腎間質鈣化由小的板片狀或同心圓樣礦質沉積聚集而成，能譜分析顯示其成分主要包含鈣和磷元素；腎盂結石則中心結構較為疏松，外層包繞板層狀致密礦質結構，其成分亦

10、包含鈣和磷元素。與維生素 D造模組大鼠不同，乙醛酸造模組大鼠腎臟鈣鹽沉積主要位于皮質和髓質交界處，且鈣鹽沉積主要位于管腔內。
　　結論：按100ng/100g體重隔日腹腔注射1,25(OH)2D3可以誘導大鼠出現(xiàn)高鈣尿、腎間質磷酸鹽鈣化和腎盂結石。本模型可應用于腎間質鈣化和高鈣尿結石的研究，且優(yōu)化造模方法可進一步優(yōu)化。
　　第三部分 高濃度1,25(OH)2D3和Ca2+誘導腎間質鈣化和結石形成的生物學機制研究
　　背

11、景和目的：Randall鈣斑是位于腎間質的鈣化，可能是腎結石形成的起始病變，而1,25(OH)2D3及其誘導的高鈣尿可以促進腎間質鈣化和腎結石形成。本研究擬進一步證實Randall鈣斑與結石的相關性，并探究高濃度1,25(OH)2D3和Ca2+促進腎間質鈣化和腎結石形成的生物學機制。
　　方法：基于腹部CT平掃影像學圖片，比較性別和年齡相匹配的結石患者和非結石患者腎乳頭密度（HU值），以進一步驗證Randall鈣斑理論?；诮Y石患

12、者和非結石患者腎乳頭組織芯片數(shù)據(jù)，靶向分析與抑制異位鈣化相關基因包括基質Gla蛋白（MGP）、骨橋蛋白（OPN）、骨鈣素（OCN）、骨保護素（OPG）和富Gla蛋白（GRP）在結石患者和非結石患者腎乳頭的表達情況，進而確定本研究的核心分子。在動物和/或細胞水平對上述核心分子基因表達情況及其功能進行驗證，并分析高鈣和高維生素D對細胞增殖、凋亡、氧化應激、細胞損傷修復以及細胞與晶體的相互作用等生物學功能的影響。
　　結果：最終納入性別

13、和年齡相匹配的結石和非結石患者各50例，結石組患者腎乳頭密度均值顯著高于非結石患者（49.81±7.12 vs40.98±5.68）。對26例草酸鈣結石患者和6例非腎結石對照者的腎乳頭組織基因芯片數(shù)據(jù)進行分析顯示，結石患者腎乳頭MGP表達下調3.15倍（p=0.05），OPN、OPG、OCN和GRP表達分別上調1.93（p=0.52）、1.16（p=0.58）、1.57（p=0.06）和2.04（p=0.08）倍。免疫組織化學染色顯示造

14、模組大鼠間質鈣化區(qū)域MGP染色強陽性，且鈣化周圍包繞著成纖維細胞特異蛋白1陽性細胞。進一步免疫組織化學染色和免疫印跡結果顯示造模組大鼠腎髓質MGP表達較對照組降低，細胞免疫熒光和免疫印跡研究發(fā)現(xiàn)高鈣和高維生素D抑制了腎小管上皮細胞MGP表達。茜素紅染色實驗發(fā)現(xiàn)高鈣和高維生素 D可誘導大鼠腎成纖維細胞周圍出現(xiàn)鈣鹽沉積，而外源性補充濃度為0.1ug/ml或0.5ug/ml的MGP后，鈣化則明顯減少甚至消失。造模組大鼠腎組織脂質過氧化產(chǎn)物丙二

15、醛顯著增高，TUNEL染色顯示腎小管細胞凋亡增多。CCK8細胞增殖實驗、流式細胞術、劃痕實驗以及晶體粘附實驗證實，高鈣高維生素D培養(yǎng)基可顯著抑制腎小管上皮細胞增殖、誘導腎小管上皮細胞凋亡，并抑制腎小管上皮細胞損傷修復能力，促進腎小管上皮細胞對一水草酸鈣晶體的粘附，但未促進其對磷酸鈣晶體的粘附。
　　結論：腎乳頭鈣化與結石密切相關，活性維生素 D聯(lián)合其誘導的高鈣微環(huán)境可能通過下調MGP的表達，同時提高腎臟的氧化應激水平、促進腎小管上