電針“內(nèi)關(guān)”穴改善自發(fā)性高血壓大鼠心肌肥厚效應(yīng)及其機(jī)制研究.pdf

1、眾所周知，高血壓是導(dǎo)致各種心血管疾病發(fā)生的最為關(guān)鍵的危害因素之一，長(zhǎng)期高血壓可以引起心臟結(jié)構(gòu)的異常及高血壓性心肌舒縮功能的損害。其中，最常見(jiàn)的病癥為高血壓性心肌肥厚，主要表現(xiàn)為心肌細(xì)胞代償性肥大，心臟間質(zhì)成纖維細(xì)胞增殖以細(xì)胞外基質(zhì)大量積聚，最終可導(dǎo)致心律失常、心肌梗死、心力衰竭和心源性猝死。相關(guān)研究揭示，高血壓-心肌肥大-心肌纖維化病理進(jìn)程的發(fā)生除了與持續(xù)高血壓引起的心肌壓力和容量超負(fù)荷有關(guān)外，多種神經(jīng)體液因素也在該病的形成過(guò)程中扮演重

2、要角色，主要包括交感神經(jīng)長(zhǎng)期過(guò)度興奮和β1-腎上腺受體(β1-AR)活性的異常增加，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)活動(dòng)的異常和相關(guān)細(xì)胞因子及生長(zhǎng)因子的活化，如腫瘤壞死因子α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(TGF-β1)及基質(zhì)外金屬蛋白酶系統(tǒng)(MMPs)等。近年來(lái)，逆轉(zhuǎn)左心室肥厚、心肌纖維化及左心室舒縮功能損害被認(rèn)為是治療慢性高血壓的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，并成為醫(yī)學(xué)界研究熱點(diǎn)。目前，盡管臨床上用于控制血壓、逆轉(zhuǎn)心肌肥大和心功能損害的許多新穎的藥物

3、不斷的涌現(xiàn)，但僅有少數(shù)高血壓患者的癥狀能夠得到較理想的控制，究其原因主要是這些藥物的低兼容性，且靶點(diǎn)較為單一，并伴有諸多毒副作用。相關(guān)研究證實(shí)，針刺某些穴位具有直接的降壓效應(yīng)，其可通過(guò)軀體-自主神經(jīng)反射影響腦干交感中樞核團(tuán)的傳出活動(dòng)，或經(jīng)興奮迷走神經(jīng)的功能活動(dòng)來(lái)對(duì)抗慢性高血壓狀態(tài)下交感神經(jīng)的過(guò)度緊張性活動(dòng)及過(guò)度激活的β1-AR。除神經(jīng)機(jī)制外，針刺還可以通過(guò)調(diào)節(jié)上述參與高血壓病理進(jìn)程的內(nèi)分泌網(wǎng)絡(luò)，包括RAS、炎癥因子和酶類等，從而改善慢性

4、高血壓及誘發(fā)癥狀。此外，針刺內(nèi)關(guān)穴可通過(guò)調(diào)節(jié)心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度及與鈣信號(hào)相關(guān)蛋白有效地改善心功能，適用于心律不齊、心絞痛、心功能不全等多種心血管疾病的治療。因此，進(jìn)一步探索和揭示針刺對(duì)高血壓-心肌肥厚-心功能損害的作用效果具有一定的科學(xué)價(jià)值和潛在的臨床應(yīng)用前景。
　　1.實(shí)驗(yàn)?zāi)康?br>　　本研究以12周齡自發(fā)性高血壓大鼠(SHR)作為研究對(duì)象，以同周齡WistarKyoto(WKY)作為對(duì)照組，采用無(wú)創(chuàng)血壓記錄和超聲心動(dòng)圖技

5、術(shù)，觀察連續(xù)8周電針“內(nèi)關(guān)”穴對(duì)SHR模型大鼠血壓和心臟結(jié)構(gòu)、功能動(dòng)態(tài)變化的影響;在確定電針有效改善高血壓-心肌肥厚/纖維化-心功能損害病理進(jìn)程的基礎(chǔ)上，通過(guò)免疫組織化學(xué)染色、Western Blotting、 Real-Time PCR和放射免疫等方法，揭示電針“內(nèi)關(guān)”穴發(fā)揮該效應(yīng)的分子生物學(xué)機(jī)制，旨在為高血壓-心肌肥厚/纖維化-心功能損害的臨床治療提供新的途徑。
　　2.實(shí)驗(yàn)方法
　　本研究實(shí)驗(yàn)分兩階段進(jìn)行。
　　

6、第一部分，主要觀察電針內(nèi)關(guān)穴抑制SHR左心室肥厚及舒縮功能損害的療效:實(shí)驗(yàn)選用SPF級(jí)健康雄性12周齡WKY10只作為正常組，另選同周齡自SHR30只，分為SHR、SHR+EA、 SHR+Sham組，每組大鼠各10只。其中，SHR+EA組選取雙側(cè)“內(nèi)關(guān)”穴干預(yù)（2/15Hz，1mA，持續(xù)30 min），每日1次，共8周。假電針組僅于內(nèi)關(guān)穴淺刺，不給予電刺激。于電針前和每周電針后采用無(wú)創(chuàng)血壓儀測(cè)量各組大鼠清醒狀態(tài)下下尾動(dòng)脈收縮壓(SBP)

7、、舒張壓(DBP)和平均動(dòng)脈壓(MAP);采用高分辨率超聲心動(dòng)圖影像系統(tǒng)分別于電針干預(yù)前及電針干預(yù)第2，4，6，8周后進(jìn)行超聲心動(dòng)圖檢查，觀察各組大鼠心肌肥厚指標(biāo)的差異。于電針干預(yù)結(jié)束后稱量左心室濕重，并計(jì)算心重體重比(HMI)，左心室心肌質(zhì)量指數(shù)(LVMI)。采用HE染色法、VG染色法，免疫熒光組織化學(xué)染色技術(shù)和Western Blotting等分析法觀察心肌組織病理組織學(xué)改變及心肌組織中collagenⅠ、collagenⅢ表達(dá)量的

8、變化。
　　第二部分，主要是對(duì)電針內(nèi)關(guān)穴延滯SHR心肌肥厚的機(jī)制探討:實(shí)驗(yàn)選SPF級(jí)健康雄性12周齡SHR18只，分為三組，即SHR、SHR+EA、 SHR+Sham組，每組大鼠各6只。同周齡的WKY作為正常血壓對(duì)照組，給予電針干預(yù)，干預(yù)方法及參數(shù)同上。于電針干預(yù)結(jié)束后，采用放射免疫法，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(Elisa法)和Real-Time PCR測(cè)定檢測(cè)大鼠心肌組織或血清中ACE含量及TNF-α的表達(dá)。采用免疫印跡法(Wester

9、n Blotting)觀察比較心肌組織AT1R、AT2R、β1-AR、TGF-β1、CTGF、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)變化。采用Real-Time PCR法觀察TGF-β1、CTGF、MMP-2、MMP-9 mRNA相對(duì)表達(dá)量的變化。通過(guò)系統(tǒng)分析電針內(nèi)關(guān)穴是否通過(guò)影響上述重要靶點(diǎn)從而達(dá)到改善高血壓心肌肥厚的效應(yīng)，以探討哪些因素可能參與了電針內(nèi)關(guān)穴改善高血壓-心肌肥厚的相關(guān)機(jī)制。
　　3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果
　　3.1.電針緩解S

10、HR左心室肥厚及心功能損害的療效觀察
　　3.1.1.電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR血壓的影響
　　各組大鼠動(dòng)態(tài)無(wú)創(chuàng)血壓記錄結(jié)果顯示，與自身的基礎(chǔ)值比較，從電針干預(yù)5周后，SHR+EA組DBP和MAP顯著降低(P＜0.05)。從電針干預(yù)6周后，SHR+EA組SBP顯著降低(P＜0.05);而SHR組大鼠SBP、DBP和MAP均顯著升高（P均＜0.05）。與WKY組比較，SHR組和SHR+Sham組的SBP、DBP和MAP均顯著升高（P均

11、＜0.05），并隨周齡增加持續(xù)上升。與SHR組比較，從電針內(nèi)關(guān)干預(yù)5周后，SHR+EA組SBP、DBP和MAP均顯著降低(P均＜0.05)，但假電針組MAP、SBP、DBP未見(jiàn)顯著變化，始終與模型組數(shù)值接近，均保持在較高水平(P＞0.05)，提示電針內(nèi)關(guān)穴能夠顯著降低SHR高血壓癥狀。
　　3.1.2.電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR大鼠心重體重比和左心室重量指數(shù)的影響
　　與WKY組相比，SHR組的心重/體重比(HW/BW)，左室重量指

12、數(shù)(LVWI)顯著升高(P＜0.001)，提示SHR出現(xiàn)心肌肥厚的表現(xiàn)。電針內(nèi)關(guān)穴可以顯著地抑制SHR組HW/BW和LVWI的升高幅度(P＜0.001，P＜0.01)，這表明電針內(nèi)關(guān)穴可有效改善SHR心肌肥厚癥狀。
　　3.1.3.電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR心肌組織形態(tài)學(xué)改變的影響
　　光鏡下觀察HE染色心肌切片可見(jiàn):與WKY組比較，SHR組左心室腔明顯縮小，心肌明顯增厚， SHR+EA組可明顯改善SHR組左心室腔縮小和心肌增厚的現(xiàn)

13、象。而與SHR組比較，SHR+Sham組，沒(méi)有明顯變化。與WKY組比較，SHR組心肌細(xì)胞腫脹并且伴有炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。電針干預(yù)八周后，心肌細(xì)胞體積不同程度減小，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象減輕。與WKY組比較，SHR組的心肌細(xì)胞直徑和橫截面積顯著增大(P＜0.05，P＜0.001)，與SHR組比較，SHR+EA組的心肌細(xì)胞直徑和橫截面積均減?。≒＜0.05，P＜0.001），而SHR+Sham組沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。以上結(jié)果表明電針內(nèi)關(guān)穴可有

14、效改善高血壓心肌肥厚狀態(tài)下心臟結(jié)構(gòu)和局部組織形態(tài)學(xué)的病理改變。
　　3.1.4.電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR心功能各項(xiàng)指標(biāo)的影響
　　WKY組隨周齡的增加，其LVAWd、LVPWd、LVIDd、LVEF、 LVFS指標(biāo)沒(méi)有顯著變化。與WKY組相比，SHR組LVAWd、LVPWd顯著升高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001)，而LVEF、LVFS、LVIDd顯著降低，提示SHR出現(xiàn)心肌肥厚表現(xiàn)。與SHR組比較，電針內(nèi)關(guān)穴6周后，

15、SHR+EA組LVAWd顯著降低(P＜0.01)，LVEF、LVFS、LVIDd顯著升高(P＜0.05，P＜0.001，P＜0.001);電針8周后， LVPWd亦顯著降低（P＜0.05），SHR+Sham組上述各指標(biāo)表現(xiàn)與SHR組一致，兩組之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果提示電針內(nèi)關(guān)穴可有效緩解SHR心肌肥厚癥狀。
　　WKY隨周齡的增加E/A比值沒(méi)有變化。與WKY組相比，SHR組的E/A比值顯著降低(P＜0.001)，提示SHR出現(xiàn)

16、了心肌舒縮功能的損害。與SHR組比較，電針內(nèi)關(guān)穴6周，SHR+EA組E/A比值顯著升高(P＜0.05，P＜0.01，P＜0.001);SHR+Sham組E/A變化與SHR組一致，且兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。這表明電針內(nèi)關(guān)穴可有效改善SHR心肌舒縮功能。
　　3.1.5.電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR心肌組織膠原分布及羥脯胺酸含量的影響
　　與WKY組比較，SHR組心肌纖維變粗，腫脹、間隙不清、斷裂、融合或排列紊亂，心肌細(xì)胞明顯肥大、濁腫，空泡

17、樣變化;細(xì)胞紅色染色較多，提示膠原纖維增生明顯。與SHR組比較，SHR+EA組上述心肌組織的病理?yè)p傷明顯減輕，紅色范圍逐漸減少，提示心肌纖維化程度逐漸減輕;而SHR+Sham組病理?yè)p傷減輕不明顯。與WKY組相比，SHR組心肌間質(zhì)膠原面積(CA)，心肌肌原容積分?jǐn)?shù)(CVF)、羥脯胺酸(Hyp)的含量顯著增高(P＜0.01，P＜0.001)。電針內(nèi)關(guān)穴可以顯著地抑制SHR組CA、CVF和Hyp的升高幅度(P＜0.05，P＜0.01)，提示電

18、針內(nèi)關(guān)穴可有效抑制SHR心肌纖維化表現(xiàn)。與SHR組比較，SHR+Sham組上述三個(gè)指標(biāo)無(wú)顯著變化。以上結(jié)果表明電針內(nèi)關(guān)穴可有效改善SHR心肌纖維化。
　　3.1.6.電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR心肌組織Ⅰ型ColⅠ、ColⅢ表達(dá)的影響
　　依據(jù)免疫染色結(jié)果，與WKY組相比，SHR細(xì)心肌間質(zhì)ColⅠ、ColⅢ熒光共表達(dá)顯著增加，說(shuō)明心肌間質(zhì)膠原沉積現(xiàn)象明顯。與SHR組比較，SHR+EA組心肌間質(zhì)ColⅠ、ColⅢ熒光共表達(dá)明顯減少，SH

19、R+Sham組ColⅠ表達(dá)亦有一定程度的降低、而ColⅢ熒光共表達(dá)變化不明顯。定量分析結(jié)果統(tǒng)計(jì)顯示:與WKY組相比，SHR組心肌組織ColⅠ、ColⅢ蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.001);與SHR組比較，SHR+EA組心肌組織ColⅠ、ColⅢ蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.001)，此外，SHR+Sham組心肌組織ColⅠ、ColⅢ蛋白表達(dá)也出現(xiàn)一定程度的降低，但沒(méi)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。以上結(jié)果表明，電針內(nèi)關(guān)穴可通過(guò)下調(diào)ColⅠ、ColⅢ蛋白表達(dá)從而

20、緩解SHR心肌纖維化。
　　3.2.電針抑制高血壓-心肌肥厚機(jī)制探討
　　3.2.1.電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR心肌組織β1-AR蛋白表達(dá)的影響
　　與WKY組相比，SHR組心肌組織β1-AR蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)。與SHR組比較，SHR+EA組心肌細(xì)胞β1-AR蛋白表達(dá)顯著下降（P＜0.001），提示電針內(nèi)關(guān)穴可能通過(guò)降低心肌細(xì)胞β1-AR表達(dá)，從而改善SHR心肌肥厚發(fā)展進(jìn)程。這表明β1-AR可能是介導(dǎo)電針抑制高血

21、壓心肌肥厚的機(jī)制之一。
　　3.2.2.電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR體內(nèi)ACE含量及心肌組織AT1R、AT2R蛋白表達(dá)的影響
　　與WKY組相比，SHR組血清和心肌組織中ACE的含量顯著升高(P＜0.001)。電針干預(yù)可明顯抑制SHR血清和心肌組織中ACE含量的異常升高(P＜0.001);SHR+Sham組上述ACE含量與SHR組無(wú)顯著差異。與WKY組相比，SHR組心肌細(xì)胞AT1R蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.001)，而AT2R蛋白表達(dá)

22、顯著降低(P＜0.001)。與SHR組比較，SHR+EA組心肌細(xì)胞AT1R蛋白表達(dá)顯著下降(P＜0.001)，AT2R蛋白表達(dá)顯著升高(P＜0.01)，提示AT1R、AT2R蛋白可能是電針內(nèi)關(guān)穴改善SHR心肌肥厚發(fā)展進(jìn)程的分子途徑之一。該部分結(jié)果提示對(duì)血管緊張素系統(tǒng)(ACE、AT1R、AT2R)的調(diào)節(jié)作用可能介導(dǎo)了電針抑制高血壓心肌肥厚的作用。
　　3.2.3.電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR血清TNF-α含量及心肌組織TNF-α mRNA表達(dá)

23、的影響
　　與WKY組相比，SHR血清中TNF-α含量及心肌組織TNF-α mRNA表達(dá)顯著升高(P＜0.001)。與SHR組比較，SHR+EA組血清中TNF-α含量及心肌組織TNF-α mRNA表達(dá)顯著下降（P＜0.001）。這表明TNF-α與高血壓心肌肥厚密切相關(guān)，調(diào)節(jié)血清和心肌組織中TNF-α含量及表達(dá)可能是介導(dǎo)電針抑制高血壓心肌肥厚的機(jī)制之一。
　　3.2.4.電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR心肌組織TGF-β1、CTGF表達(dá)的影

24、響
　　與WKY組相比，SHR組心肌間質(zhì)TGF-β1和CTGF的熒光強(qiáng)度，蛋白及mRNA相列表達(dá)量顯著升高(P＜0.001)。與SHR組比較， SHR+EA組心肌組織TGF-β1和CTGF的熒光強(qiáng)度，蛋白及mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著下降(P＜0.01，P＜0.001)。提示電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR組TGF-β1和CTGF異常表達(dá)的下調(diào)作用可能介導(dǎo)了電針緩解高血壓心肌肥厚的作用。
　　3.2.5.電針內(nèi)關(guān)穴對(duì)SHR心肌組織MMP-2、M

25、MP-9 mRNA及其蛋白表達(dá)的影響
　　各組間MMP-2 mRNA及其蛋白表達(dá)無(wú)顯著差異。提示由于各組之間的MMP-2 mRNA及其蛋白表達(dá)沒(méi)有明顯的區(qū)別，因此，不能肯定MMP-2參與了介導(dǎo)電針抑制高血壓心肌肥厚的作用。與WKY組相比，SHR組心肌組織MMP-9mRNA及其蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.001）。與SHR組比較，SHR+EA組心肌組織MMP-9蛋白表達(dá)及mRNA相對(duì)表達(dá)量顯著升高（P＜0.05），但SHR+Sham組

26、MMP-9蛋白表達(dá)及mRNA相對(duì)表達(dá)量未見(jiàn)顯著變化。提示MMP-9可能介導(dǎo)了電針抑制心肌纖維化的進(jìn)程。
　　4.結(jié)論
　　SHR除表現(xiàn)為血壓升高外，其左心室壁厚度、HW/BW、LVWI顯著增加，射血功能明顯減弱，CVF及Hyp、collagenⅠ、collagenⅢ的表達(dá)異常增高，說(shuō)明出現(xiàn)心肌肥厚為主要特征的心肌重塑，并伴有心功能受損。電針內(nèi)關(guān)穴可以顯著地抑制SHR血壓的升高，改善心室厚度、LVEF等心功能指標(biāo)，抑制HW/B

27、W、LVWI等的異常增加，此外，電針內(nèi)關(guān)穴一定程度上改善了SHR心肌組織形態(tài)，減少了SHR心肌細(xì)胞直徑和橫截面積和CVF的過(guò)度增加，抑制了SHR心肌組織Hyp、collagenⅠ和collagenⅢ的異常表達(dá)，提示電針改善SHR高血壓心肌肥厚發(fā)展進(jìn)程療效明確。
　　電針內(nèi)關(guān)穴在改善高血壓-心肌肥厚的同時(shí)，可以明顯抑制SHR血清或心肌組織中ACE、β1-AR、AT1R、TNF-α、TGF-β1、CTGF、MMP-9的異常表達(dá)，提示血