基于納米材料與信號(hào)放大技術(shù)構(gòu)建電化學(xué)免疫傳感器檢疫家蠶微粒子病的研究.pdf

1、微粒子?。≒ebrine）是蠶業(yè)生產(chǎn)上危害最為嚴(yán)重的疫病之一，曾造成17世紀(jì)歐洲養(yǎng)蠶業(yè)的衰落。它既可水平傳染，也可經(jīng)卵垂直傳播，已被世界各個(gè)蠶業(yè)生產(chǎn)國(guó)列為蠶種生產(chǎn)的唯一法定檢疫對(duì)象，其病原是家蠶微孢子蟲(chóng)。目前，微孢子蟲(chóng)的檢疫主要采用母蛾鏡檢法，然而此法對(duì)工作人員的技術(shù)要求高，檢測(cè)過(guò)程費(fèi)時(shí)費(fèi)力，并且還存在易將與微孢子蟲(chóng)形態(tài)相似的其他微生物和微孢子蟲(chóng)混淆，從而降低檢測(cè)的準(zhǔn)確性。因此，目前生產(chǎn)上亟需能夠快速、靈敏、有效的微孢子蟲(chóng)檢測(cè)方法，以輔

2、助或取代母蛾鏡檢法。電化學(xué)生物傳感器是一種結(jié)合生物學(xué)技術(shù)與電化學(xué)分析方法而發(fā)展起來(lái)的分析檢測(cè)技術(shù)，它具有很多優(yōu)點(diǎn)比如靈敏度高、選擇性好、成本低以及操作簡(jiǎn)便快速等，并在分析領(lǐng)域呈現(xiàn)出非常廣闊的應(yīng)用前景。若能憑借電化學(xué)分析技術(shù)的優(yōu)點(diǎn)構(gòu)建電化學(xué)生物傳感器用于家蠶微孢子蟲(chóng)靶標(biāo)蛋白的檢測(cè)，此檢測(cè)方法就具有電化學(xué)生物傳感器的優(yōu)點(diǎn)。因此，本論文擬以家蠶微粒子病的靶標(biāo)蛋白為研究對(duì)象，結(jié)合多種納米材料及信號(hào)放大技術(shù)構(gòu)建靈敏的電化學(xué)生物傳感器實(shí)現(xiàn)對(duì)家蠶微粒

3、子病靶標(biāo)蛋白的定量檢測(cè)。本研究工作主要分為下幾個(gè)部分：
　　1.基于鉑鈀納米線(xiàn)和卟啉鐵G-四分體簇催化NADH構(gòu)建雙酶催化信號(hào)放大的電化學(xué)傳感器。
　　通過(guò)雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（HCR）在鉑鈀納米線(xiàn)表面形成大量具有仿雙酶作用的卟啉鐵G-四分體簇，由于它同時(shí)具有HRP模擬酶和NADH氧化酶的作用，以此構(gòu)建了仿雙酶夾心式電化學(xué)免疫傳感器用于微孢子蟲(chóng)孢壁蛋白的檢測(cè)。一方面，由于合成的鉑鈀納米線(xiàn)具有大的比表面積，可增大卟啉鐵G-四分體簇的固

4、載量，從而提高酶催化信號(hào)放大的能力；另一方面，卟啉鐵G-四分體仿酶簇在體系中的引用，不僅成功實(shí)現(xiàn)了雙倍信號(hào)放大，還避免了使用蛋白酶易失活、價(jià)格昂貴的缺點(diǎn)。由于抗體和靶標(biāo)蛋白本身為非電活性物質(zhì)，因此大部分電化學(xué)傳感器都需要標(biāo)記相應(yīng)的電子媒介體以得到可定量檢測(cè)的電化學(xué)信號(hào)。然而電子媒介體的標(biāo)記過(guò)程復(fù)雜、耗時(shí)、成本較高，且標(biāo)記過(guò)程可能會(huì)影響抗體或電子媒介體的生物活性。因此本體系直接采用在卟啉鐵G-四分體簇中嵌入的卟啉鐵作為電子媒介體，無(wú)需進(jìn)行

5、標(biāo)記，與其它檢測(cè)微孢子蟲(chóng)的方法相比，本方法具有操作簡(jiǎn)單、響應(yīng)快、特異性強(qiáng)、成本低等優(yōu)點(diǎn)，為微粒子病的診斷提供了一個(gè)新的檢測(cè)方法。
　　2.基于C60@Pt-Pd復(fù)合納米粒子和卟啉鐵G-四分體簇催化L-半胱氨酸構(gòu)建雙酶催化信號(hào)放大的電化學(xué)傳感器。
　　卟啉鐵G-四分體簇可以催化氧化煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NADH）產(chǎn)生過(guò)氧化氫，而產(chǎn)生的過(guò)氧化氫可以繼續(xù)被卟啉鐵G-四分體簇催化分解，從而加速了電極與電子媒介體之間電子的轉(zhuǎn)移，達(dá)到信

6、號(hào)放大的目的。據(jù)最新研究發(fā)現(xiàn)，卟啉鐵G-四分體簇也可以催化氧化L-半胱氨酸產(chǎn)生過(guò)氧化氫，經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)采用L-半胱氨酸作為酶催化底物比上一體系中采用NADH作為催化底物具有更高的信號(hào)放大效果。另外，本實(shí)驗(yàn)中新合成的C60@Pt-Pd復(fù)合納米粒子，不僅克服了C60難溶于水不易水相功能化的缺點(diǎn)，同時(shí)作為二抗的載體具有大的比表面積且表面功能化的鉑鈀納米粒子具有優(yōu)良的導(dǎo)電性和催化作用，可進(jìn)一步提高電化學(xué)傳感器的靈敏度。經(jīng)過(guò)以上的改進(jìn)，本實(shí)驗(yàn)所構(gòu)

7、建的傳感器在靈敏度上較之前的工作有了提升，線(xiàn)性范圍在0.001ng mL-1到100ng mL-1范圍內(nèi)。
　　3.基于鄰觸反應(yīng)體系和共固載催化劑與催化底物構(gòu)建信號(hào)放大的電化學(xué)傳感器
　　酶催化信號(hào)放大策略是在放大電化學(xué)傳感器信號(hào)方面比較經(jīng)典且常用的一種方法，對(duì)提高傳感器的靈敏度具有非常重要的幫助。盡管隨著研究的深入，酶催化信號(hào)放大策略已經(jīng)克服了使用蛋白酶的缺點(diǎn)，且已成功構(gòu)建了仿雙酶以及仿三酶催化信號(hào)放大的體系。但酶催化的底

8、物在檢測(cè)過(guò)程中都需要將其加入到檢測(cè)底液中，這不僅會(huì)使檢測(cè)操作變得復(fù)雜和專(zhuān)業(yè)的缺點(diǎn)，還會(huì)導(dǎo)致催化劑和催化底物的作用距離較遠(yuǎn)，催化效率受限。若能將催化劑和催化底物同時(shí)都固載在電極表面，就可以成功克服傳統(tǒng)酶催化信號(hào)放大策略所面臨的這一瓶頸。因此，本實(shí)驗(yàn)我們結(jié)合一種較新的分析體系（它同時(shí)結(jié)合了鄰位分析和電化學(xué)分析的優(yōu)點(diǎn)），利用四氧化三鐵能催化染料小分子的這一特殊的性能，同時(shí)共固載催化劑和催化底物于電極表面，此分析體系在信號(hào)放大時(shí)不需要再在檢測(cè)底