激光捕獲顯微切割聯(lián)合分子生物學(xué)技術(shù)在研究組織病原學(xué)菌群多樣性方面的應(yīng)用.pdf

1、第一部分:激光捕獲顯微切割聯(lián)合DGGE技術(shù)對比臨床培養(yǎng)分析新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎腸壁組織菌群多樣性
　　[目的]從分子生物學(xué)的角度對比臨床培養(yǎng)方法，初步探討新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎腸壁組織的菌群多樣性，為全面認識新生兒壞死性小腸結(jié)腸炎(NEC)病原菌提供新的視角。
　　[方法]對18例NEC腸壁組織標(biāo)本和7例腸閉鎖組織標(biāo)本病理切片后，行革蘭染色觀察，并對新鮮標(biāo)本行電鏡觀察。采用激光捕獲顯微切割技術(shù)(LCM)直視下分離組織中細菌

2、，經(jīng)DNA提取、PCR擴增后，進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析并與臨床培養(yǎng)結(jié)果對比。
　　[結(jié)果]①臨床培養(yǎng):陽性率為33.3％，共檢出4個菌屬，其中肺炎克雷伯菌肺炎亞種66.7％，中間鏈球菌、大腸埃希菌、奇異變形桿菌各占16.7％，各標(biāo)本檢出菌屬數(shù)為0～2種，且每例標(biāo)本中培養(yǎng)出的菌屬均可由DGGE檢出。②DGGE方法:NEC組共檢測出16個菌屬，以革蘭陰性菌為主，各標(biāo)本菌種檢出數(shù)為7～16種，平均（12.17±2.83）個菌

3、屬，所有優(yōu)勢菌屬中變形菌門占65.6％，其中γ變形菌門比例最多占48.1％，厚壁菌門占30.5％;對照組共檢測出10個菌屬，各標(biāo)本菌種檢出數(shù)在1～6種，變形菌門占44.4％，厚壁菌門占50.0％。對比發(fā)現(xiàn)變形菌門中的假單胞菌屬、不動桿菌屬、克雷伯菌屬、蒼白桿菌屬及厚壁菌門中的梭形芽孢桿菌屬等6種菌屬僅在NEC腸組織中檢出。
　　[結(jié)論]NEC是以革蘭陰性菌為主的多種細菌混合感染。NEC患兒腸道內(nèi)菌群發(fā)生改變，變形菌門相對增加，厚壁

4、菌門相對減少。LCM聯(lián)合PCR-DGGE技術(shù)病原菌檢出率較高，可為組織病原學(xué)研究提供新的思路。
　　第二部分:16S rDNA-變性梯度凝膠電泳技術(shù)與臨床培養(yǎng)方法對比分析兒童闌尾炎組織菌群多樣性
　　[目的]從分子生物學(xué)的角度初步探討兒童闌尾炎組織的菌群多樣性，為全面認識闌尾炎癥組織病原菌提供新的視角。
　　[方法]對10例闌尾炎組織標(biāo)本和4例正常闌尾組織標(biāo)本病理切片后，行革蘭染色觀察菌群情況，采用激光捕獲顯微切割技術(shù)

5、(LCM)直視下分離組織中的細菌，經(jīng)DNA提取、PCR擴增后，進行變性梯度凝膠電泳(DGGE)分析并與臨床培養(yǎng)結(jié)果對比。
　　[結(jié)果]①臨床培養(yǎng)法:陽性率為70％，共檢測到4個菌屬，以大腸埃希菌最多見，各標(biāo)本菌屬0～2種，且均可由DGGE檢出。②DGGE方法:共檢測到14個菌屬，包括可培養(yǎng)菌屬和無法培養(yǎng)的菌屬，以革蘭陰性菌為主;10例闌尾炎標(biāo)本包含的細菌種類和數(shù)目均有差異，各標(biāo)本菌屬平均9.6(6～12)種;變形菌門比例為71.3