小鼠甲狀腺來源間充質(zhì)干細胞的生物學特性研究.pdf

1、目的：
　　探索小鼠甲狀腺來源間充質(zhì)干細胞的生物學特性，比較其與骨實質(zhì)來源間充質(zhì)干細胞是否具有差異，為臨床研究自身免疫性甲狀腺炎的發(fā)病機制提供理論與實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1、采用組織貼壁培養(yǎng)法，體外無菌分離并培養(yǎng)C57BL/6小鼠甲狀腺來源間充質(zhì)干細胞（Thyroid derived Mesenchymal Stem Cells，TMSCs），以小鼠骨實質(zhì)來源間充質(zhì)干細胞（Boneessence derivedM

2、esenchymalStemCells, BMSCs）作對照，通過倒置顯微鏡觀察貼壁細胞形態(tài)，然后利用不同誘導劑誘導貼壁細胞向成脂肪、成骨分化，油紅O染色檢測成脂分化能力，堿性磷酸酶及Von Kossa染色檢測成骨分化能力，Q-PCR檢測相關成脂肪和成骨關鍵轉錄因子的表達。進一步，采用 CCK8法檢測貼壁細胞生長曲線，流式細胞儀檢測細胞表型和細胞周期。
　　2、在獲得小鼠甲狀腺來源 MSCs的基礎上，采用淋巴母細胞轉化實驗（Lym

3、phocyte transformation test，LTT)和混合淋巴細胞反應（Mixed Lymphocyte Reaction，MLR)檢測MSCs對T細胞增殖的免疫抑制功能。進一步，將甲狀腺來源 MSCs與 DC共培養(yǎng)，倒置顯微鏡下觀察 DC形態(tài)改變，流式細胞術檢測DC表面抗原的表達，Q-PCR法在 mRNA水平檢測促炎因子 IFN-γ、TNF-α和IL-12的表達水平。
　　3、建立異體鼠尾皮瓣移植模型，檢測甲狀腺來源

4、MSCs體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)及修復受損組織的能力。將小鼠甲狀腺來源 MSCs通過尾靜脈輸注模型小鼠體內(nèi)，每日觀察移植皮瓣炎癥反應程度和愈合情況，第7天行病理學檢測移植皮瓣組織淋巴細胞浸潤程度。
　　結果：
　　1、從小鼠甲狀腺和骨實質(zhì)組織中均可培養(yǎng)出貼壁生長的成纖維樣的細胞，流式細胞儀檢測相關細胞表型，兩種細胞均陽性表達CD29、CD140、CD105和Sca-1，而不表達CD34、CD45、CD31、CD11b和MHCII。進一步

5、，將細胞向脂肪和骨細胞誘導分化，結果顯示，細胞可被誘導成脂肪，油紅染色可見有大量脂滴出現(xiàn)，Q-PCR檢測可見脂肪分化關鍵轉錄因子C/EBPα和PPARγ的表達；成骨誘導分化后，堿性磷酸酶染色可見堿性磷酸酶活性增高，Von Kossa染色可見鈣化骨結節(jié)形成，Q-PCR檢測可見成骨關鍵轉錄因子RunX2和Osteocalcin的表達，說明成功獲得小鼠甲狀腺來源MSCs。利用CCK8法檢測甲狀腺來源MSCs的生長特性，結果顯示，細胞呈S型曲線

6、生長，流式細胞術檢測細胞周期，可見80％以上細胞分布在G0/G1期,提示獲得的貼壁細胞符合干細胞的生長特性。
　　2、在獲得TMSCs的基礎上，針對MSCs獨特的免疫調(diào)節(jié)功能進行LLT和MLR檢測。LTT檢測TMSCs對ConA刺激的T淋巴細胞增殖能力的影響，結果表明， TMSCs可有效抑制ConA刺激的T淋巴細胞增殖能力，且隨著TMSCs量的增加，其抑制作用顯著增強(P＜0.05)；利用異體淋巴細胞刺激的MLR實驗也得到相同的實

7、驗結果，即MSCs抑制異體淋巴細胞抗原刺激的T細胞增殖能力隨著MSCs數(shù)量的增加，其抑制作用顯著增強(P＜.05)。
　　3、DC作為抗原遞呈細胞，在免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮重要作用，同時MSCs對DC功能也具有重要的調(diào)節(jié)作用。為此，我們在體外利用MSCs與DC共培養(yǎng)體系，觀察甲狀腺來源MSCs對DC功能的影響，結果顯示，與甲狀腺來源MSCs共培養(yǎng)的DC，其形態(tài)表現(xiàn)為細胞樹狀突起少而短；流式細胞儀檢測DC細胞表面抗原表達，可見CD11c、C

8、D80、CD86和MHCII表達量均顯著下降；Q-PCR檢測相關促炎因子IFN-γ、TNF-α和IL-12 mRNA的表達亦顯著下降(P＜0.05)。
　　4、利用小鼠尾部皮瓣移植模型檢測甲狀腺來源 MSCs的體內(nèi)免疫調(diào)節(jié)功能和組織修復能力，結果表明，TMSCs與 BMSCs相似，具有修復鼠尾皮瓣損傷的能力，皮瓣損傷愈合較對照組快。病理切片結果顯示，TMSC治療小鼠皮瓣組淋巴細胞浸潤程度較對照組低，提示TMSCs可有效促進皮瓣損傷

9、愈合，減輕炎癥反應。
　　結論：
　　1、成功分離獲得小鼠甲狀腺來源MSCs，其細胞形態(tài)、免疫表型、誘導分化能力和細胞增殖特性均與骨實質(zhì)來源MSCs相似。
　　2、通過體外LTT和MLR實驗結果表明，小鼠TMSCs具有免疫調(diào)節(jié)能力，在體外可抑制 ConA和異種抗原刺激的T淋巴細胞的增殖，且具有明顯的劑量依賴性。同時，TMSCs對抗原遞呈細胞DC的免疫功能也具有調(diào)節(jié)作用，可顯著抑制DC的成熟。
　　3、體內(nèi)異體鼠尾