ESRD血液透析患者血漿microRNA與炎癥因子的關(guān)系.pdf

1、背景：
　　終末期腎臟病（end-stage renal disease,ESRD）死亡率和致殘率高，是國(guó)民醫(yī)療的重大支出之一。目前已有很多研究發(fā)現(xiàn)，ESRD血液透析患者普遍存在微炎癥狀態(tài)，繼發(fā)蛋白能量消耗(protein-energy wasting,PEW)，內(nèi)分泌紊亂，增加心血管疾病等多種并發(fā)癥的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)或成為其加重因素。因此，干預(yù)ESRD患者的微炎癥狀態(tài)，對(duì)于改善其預(yù)后、減少并發(fā)癥具有重要的理論意義。外周血循環(huán)中含有Mic

2、roRNAs，通常以外泌體的形式被分泌到細(xì)胞外，它是一種內(nèi)源性的非編碼RNA分子，長(zhǎng)度一般在19-24個(gè)核苷酸序列。我們發(fā)現(xiàn)miR-574-5p和miR-32-3P富含GU序列，該序列與激活TLR7/TLR8（Toll-likeReceptors,TLRs）的單鏈RNA接近。TLRs通過(guò)識(shí)別和結(jié)合相應(yīng)的病原相關(guān)分子模式（Pathogen-Associated Molecular Patterns,PAMPs)，激活轉(zhuǎn)錄因子，活化炎癥因子

3、和趨化因子的表達(dá)。其中TLR7和TLR8信號(hào)傳導(dǎo)依賴于核內(nèi)體酸化傳導(dǎo)，并通過(guò)識(shí)別核內(nèi)體或溶酶體區(qū)室中的ssRNA，導(dǎo)致炎癥和調(diào)節(jié)性細(xì)胞因子的分泌。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)研究ESRD患者外周血中的miR-32-3p,miR-574-5p的表達(dá)水平以及和炎癥因子白介素-6(Interleukin6,IL-6)和腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)的水平的關(guān)系，探討miR-32-3p,miR-574-5p在ESRD血

4、液透析患者炎癥狀態(tài)中的意義，從而為進(jìn)一步干預(yù)ESRD患者的微炎癥狀態(tài)提供理論依據(jù)。
　　實(shí)驗(yàn)方法：
　　共納入符合標(biāo)準(zhǔn)的ESRD血液透析患者30例，健康對(duì)照組10例。根據(jù)2012年改善全球腎臟病預(yù)后組織（Kidney Disease Improving Global Outcomes,KDIGO）CKD評(píng)估與管理臨床實(shí)踐指南中對(duì)ESRD的定義為標(biāo)準(zhǔn)，選取接受維持性血液透析（每周3次）的患者作為實(shí)驗(yàn)組，同時(shí)需排除下列患者：年齡

5、>75歲患者，入組前3個(gè)月內(nèi)使用糖皮質(zhì)激素和／或其他免疫抑制劑治療，或并發(fā)腫瘤、急性冠脈綜合征、腦卒中、肝和血液系統(tǒng)疾病、自身免疫性疾病腎損害、活動(dòng)性結(jié)核、急性感染、消化道出血及心衰等并發(fā)癥患者。選取在大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院體檢中心采集年齡、性別與上述終末期腎臟病患者匹配的無(wú)重大疾病史的健康人作為正常對(duì)照組。
　　采集外周血2ml于EDTA抗凝管中，離心后提取血漿。應(yīng)用德國(guó)Qiagen公司的MiRNeasySerum／Plasm

6、a Kit試劑盒提取microRNA。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)法測(cè)定miR-32-3p,miR-574-5p的相對(duì)表達(dá)量。于大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院檢驗(yàn)科應(yīng)用化學(xué)發(fā)光（抗原抗體反應(yīng)）法進(jìn)行IL-6和TNF-α的檢測(cè)。
　　所有計(jì)量資料通過(guò)±s表示，應(yīng)用SPSS version19.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。如計(jì)量資料服從正態(tài)分布，兩組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。計(jì)量資料不服從正態(tài)分布則采用Mann-Whi

7、tney U檢驗(yàn)。通過(guò)相對(duì)定量法（2-ΔΔCt法）計(jì)算出實(shí)驗(yàn)組與正常對(duì)照組miR-32-3p，miR-574-5p的相對(duì)表達(dá)水平。miR-32-3p，miR-574-5p與IL-6,TNF-α的相互關(guān)系采用Spearman相關(guān)性分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1.與對(duì)照組相比miR-574-5p的相對(duì)表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組中顯著上調(diào)。實(shí)驗(yàn)組miR-574-5p相對(duì)表達(dá)水平均值為11.50±11.70，對(duì)照

8、組為平均值為1.29±0.90，經(jīng)Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P<0.01(P=0.001)故兩組間miR-574-5p相對(duì)表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　2.與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組IL-6水平顯著升高。實(shí)驗(yàn)組IL-6水平均值為15.35±13.49，對(duì)照組為平均值為1.46±1.32，經(jīng)Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P<0.05(P=0.001)故兩組間IL-6表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　3.與對(duì)照組相比實(shí)驗(yàn)組TNF

9、-α水平顯著升高。實(shí)驗(yàn)組TNF-α水平平均值為55.39±48.62，對(duì)照組平均值為9.38±2.69，經(jīng)Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P<0.05(P=0.001)故兩組間TNF-α表達(dá)水平具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　4.與對(duì)照組相比miR-32-3p的相對(duì)表達(dá)水平在實(shí)驗(yàn)組未見(jiàn)顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。實(shí)驗(yàn)組miR-32-3p相對(duì)表達(dá)水平均值為2.09±1.63，對(duì)照組為平均值為1.29±1.05，經(jīng)Mann-Whitney U檢驗(yàn)，P>0

10、.05故兩組間miR-32-3p相對(duì)表達(dá)水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　5. Spearman相關(guān)性分析：
　　(1)miR-574-5p在實(shí)驗(yàn)組中的相對(duì)表達(dá)與IL-6具有正相關(guān)關(guān)系，P<0.01(P=0.001)，相關(guān)系數(shù)r=0.79。
　　(2)miR-574-5p在實(shí)驗(yàn)組中的相對(duì)表達(dá)于TNF-α具有正相關(guān)關(guān)系，P<0.01(0.001)，相關(guān)系數(shù)r=0.50。
　　(3)miR-32-3p在實(shí)驗(yàn)組中的相對(duì)表達(dá)于IL