小干擾RNA沉默YAP基因?qū)θ搜乐苣じ杉毎飳W行為的影響.pdf

1、牙周膜是一個自我更新的系統(tǒng)，牙周組織中存在一種原始的、可產(chǎn)生不同表型的間充質(zhì)干細胞(Mesenchymal stem cells，MSCs)，后將其命名為牙周膜干細胞（Periodontal ligament stem cells，PDLSCs）。自2004年被發(fā)現(xiàn)以來，PDLSCs即引起口腔界地極大關(guān)注，它除具有干細胞基本特性外，還具有形成骨樣、牙骨質(zhì)樣及牙周韌帶樣結(jié)構(gòu)組織的特性，越來越多地研究證實PDLSCs在維持牙周組織動態(tài)平衡和

2、缺損修復(fù)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。因此，PDLSCs被認為是牙周組織工程中最具有潛力的種子細胞。然而，PDLSCs的組織來源少，體外擴增極易老化，并且增殖活性和分化潛能受供體年齡和身體狀況等多種因素的影響，這使PDLSCs的研究應(yīng)用受到極大限制。
　　干細胞生命活動受多種信號通路的調(diào)控，在不同的時間空間條件下，干細胞有絲分裂可能會走向老化、凋亡、分化等不同的命運。Hippo信號通路是新近發(fā)現(xiàn)的一種與控制器官大小和腫瘤形成有關(guān)的蛋白激酶級聯(lián)通

3、路，YAP(Yes-associated protein)是此通路中一個重要的信號蛋白，Hippo上游分子主要通過調(diào)控YAP活性從而介導(dǎo)不同的生物學功能。YAP在多種組織干細胞和前體細胞中均見有高表達，在維持干細胞特性、促進細胞自我更新方面發(fā)揮重要作用。已有研究表明Hippo信號通路參與小鼠牙齒發(fā)育過程，改變牙源性上皮細胞YAP的表達會導(dǎo)致牙齒形態(tài)發(fā)生和結(jié)構(gòu)的異常，目前尚未見YAP對PDLSCs作用的相關(guān)報導(dǎo)與研究。
　　此外，H

4、ippo信號通路和與形態(tài)發(fā)生相關(guān)的TGF-β、Writ等信號通路存在多種交叉會話，各通路之間信號傳遞從而組成一種高度復(fù)雜而有序地的信息網(wǎng)絡(luò)，從而有序協(xié)調(diào)地調(diào)控細胞生長。目前關(guān)于PDLSCs的細胞生物學特性調(diào)控機制尚不十分明確。
　　目的：
　　本實驗擬采用小干擾RNA(Small interfering RNA，siRNA)沉默人牙周膜干細胞(Human-periodontal ligament stem cells，h-P

5、DLSCs) YAP基因，研究YAP基因沉默對hPDLSCs增殖、凋亡及成骨向分化等生物學行為的影響。
　　材料和方法：
　　1.原代h-PDLSCs的獲取經(jīng)酶解組織塊法分離、有限稀釋克隆法純化、流式細胞儀分析檢測細胞表面標記;擴大培養(yǎng)。
　　2.設(shè)計并化學合成siRNA序列，非特異性序列一條、人YAP靶向siRNA序列三條，以脂質(zhì)體LipofectamineTM2000為載體將siRNA序列轉(zhuǎn)入h-PDLSCs，分別

6、設(shè)為NC(Negative Control)、siRNA-1、2、3組，僅使用LipofectamineTM2000脂質(zhì)體干預(yù)組設(shè)為空白組。采用實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（Reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）、蛋白質(zhì)印跡法(Western blot)檢測轉(zhuǎn)染后YAP表達水平。
　　3.分別于轉(zhuǎn)染后1、2、3、4、5天五個時間點，使用細胞增殖活性檢測試劑盒

7、(CCK-8)檢測YAP-siRNA對h-PDLSCs增殖活性的影響;于轉(zhuǎn)染后72h使用細胞周期檢測試劑盒流式檢測分析siRNA干擾后細胞周期分布，并檢測YAP下游轉(zhuǎn)導(dǎo)細胞增殖與皮間轉(zhuǎn)化信號等相關(guān)的靶基因——結(jié)締組織生長因子(Connective tissue growth factor，CTGF)表達水平。
　　4.于轉(zhuǎn)染后72h，使用細胞凋亡檢測試劑盒通過流式細胞儀檢測siRNA干擾后細胞凋亡率的變化。
　　5.采用RT

8、-PCR技術(shù)檢測YAP-siRNA干擾后h-PDLSCs成骨相關(guān)基因(RUNX2、OCN、ALP、CollagenⅠ)的表達水平。
　　6.采用SPSS19.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，設(shè)P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。
　　結(jié)果：
　　流式細胞儀檢測細胞表達表面標記:MSCs表面標記CD73+、CD44+等(98％～99.4％)，造血干細胞表面標記CD45-、HLA-DR等-（0.28±0.012％），本實驗分離培養(yǎng)獲得細

9、胞為h-PDLSCs;在YAP-siRNA轉(zhuǎn)染后48小時，siRNA-1組、siRNA-2組與空白組和NC組相比，h-PDLSCs的YAP mRNA和蛋白表達水平均明顯降低(P＜0.01)，且蛋白表達水平在被轉(zhuǎn)染后48、72小時之間無顯著差異，另外，這表明本實驗設(shè)計合成的siRNA-1、siRNA-2序列可以持續(xù)特異有效地抑制YAP的表達;CCK-8增殖活性實驗結(jié)果顯示siRNA-1、siRNA-2組細胞增殖活性受到明顯抑制，流式細胞儀

10、檢測結(jié)果顯示siRNA-1、siRNA-2組h-PDLSCs細胞周期也發(fā)生改變——G0/G1及S期細胞比例增多(P＜0.01)、G2期細胞比例明顯減少(P＜0.05)，YAP下游靶基因CTGF蛋白表達量也降低;流式細胞儀檢測細胞凋亡率顯示siRNA-1、siRNA-2組h-PDLSCs早期及晚期凋亡率均增加;YAP-siRNA轉(zhuǎn)染后h-PDLSCs成骨相關(guān)基因(CollagenⅠ、ALP、OCN)的mRNA表達水平顯著升高，尤以O(shè)CN最

11、為明顯。
　　結(jié)論：
　　siRNA沉默YAP基因后h-PDLSCs增殖活性降低，細胞周期分布發(fā)生改變——被阻滯于G0/G1及S期，h-PDLSCs凋亡率明顯增加，由此可見，h-PDLSCs表達的YAP可促進h-PDLSCs增殖并抑制凋亡。此外，細胞增殖活性的改變可能與細胞周期被阻滯、細胞凋亡率增加有關(guān)，我們還推測YAP下游靶基因CTGF在這一過程中介導(dǎo)重要功能但需進一步驗證;在YAP基因沉默后h-PDLSCs高表達成骨分化