擬南芥AtbHLH112基因調(diào)控植物抗逆機(jī)制的研究.pdf

1、bHLH(basic/helix-loop-helix)家族是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一，它們的結(jié)構(gòu)特性是都含有一個(gè)由60～100個(gè)氨基酸構(gòu)成的高度保守的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域，包含2個(gè)功能不同的區(qū)域，即basic區(qū)域和HLH區(qū)域。絕大多數(shù)植物bHLH轉(zhuǎn)錄因子能夠通過(guò)識(shí)別G-box元件參與諸如生長(zhǎng)發(fā)育、營(yíng)養(yǎng)吸收、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、抗逆境脅追等方面的應(yīng)答。本研究通過(guò)對(duì)AtbHLH112基因過(guò)表達(dá)、抑制表達(dá)、野生型以及AtbHLH112基因缺失突變體植

2、株在ABA、NaCl和Manntiol三種脅迫下的比較分析，證明AtbHLH112過(guò)表達(dá)植株的抗逆能力明顯提高，說(shuō)明AtbHLH112基因在擬南芥植株內(nèi)發(fā)揮著非常重要的抗逆功能。利用基因槍瞬時(shí)轉(zhuǎn)化技術(shù)將AtbHLH112與GFP的融合表達(dá)載體pROK2-AtbHLH112-GFP轉(zhuǎn)化入洋蔥表皮進(jìn)行亞細(xì)胞定位，結(jié)果表明AtbHLH112轉(zhuǎn)錄因子定位在細(xì)胞核中。
　　將AtbHLH112基因上游1320 bp的啟動(dòng)子與GUS融合構(gòu)建植

3、物報(bào)告表達(dá)載體p1301-AtbHLH112并轉(zhuǎn)化擬南芥，GUS化學(xué)染色表明，AtbHLH112基因的啟動(dòng)子具有強(qiáng)的表達(dá)活性，且具有組織特異性。通過(guò)PLACE和PlantCARE數(shù)據(jù)庫(kù)預(yù)測(cè)分析發(fā)現(xiàn)， AtbHLH112基因啟動(dòng)子序列上含有ARR1TA、GTGANTG10、MYCCONSENSUSAT、 MYBCORE、MYBST1和WRKY71OS等與信號(hào)傳遞途徑相關(guān)以及植物抗逆相關(guān)的順式作用元件。通過(guò)酵母單雜交分析篩選到能夠特異識(shí)別A

4、tbHLH112基因啟動(dòng)子上E-box元件和W-box元件，從而調(diào)控AtbHLH112表達(dá)的上游基因各1條，即AtPP2C24和AtWRKY66。進(jìn)一步的熒光實(shí)時(shí)定量RT-PCR結(jié)果表明，AtPP2C24和AtWRKY66基因在脅迫下的表達(dá)模式與AtbHLH112基因相似，該結(jié)果也提示三個(gè)基因可能屬于響應(yīng)逆境脅迫的同一表達(dá)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。利用酵母單雜交等技術(shù)對(duì)AtbHLH112與順式作用元件G-box的互作研究結(jié)果表明，Atb HLH112轉(zhuǎn)

5、錄因子能夠特異性地識(shí)別G-box順式作用元件，且AtbHLH112轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合域靠近基因C端。利用Agilent擬南芥全基因組表達(dá)譜芯片技術(shù)對(duì)AtbHLH112基因過(guò)表達(dá)植株與突變體植株在正常和鹽脅迫條件的差異基因進(jìn)行比較分析。非脅迫條件下共得到差異表達(dá)基因4159條（P≤0.05;FC≥2）;鹽脅迫下共得到差異表達(dá)基因2862條（P≤0.05;FC≥2）。
　　結(jié)果顯示:AtbHLH112基因能夠調(diào)控一系列相關(guān)基因的表達(dá)

6、，特別是核糖體蛋白、熱激蛋白、轉(zhuǎn)導(dǎo)素蛋白、細(xì)胞周期蛋、抗病性蛋白的相關(guān)基因以及多種轉(zhuǎn)錄因子，如NAC、WRKY、DOF、MYB、ZFP、ERF、TCP等等。酵母雙雜交分析結(jié)果顯示，AtbHLH112轉(zhuǎn)錄因子單體具有轉(zhuǎn)錄自激活活性，且自激活結(jié)構(gòu)域靠近基因N端。將不含轉(zhuǎn)錄自激活結(jié)構(gòu)域的AtbHLH112片段與擬南芥cDNA文庫(kù)菌株進(jìn)酵母雙雜交，共得到7個(gè)能夠與AtbHLH112轉(zhuǎn)錄因子互作的蛋白，包括2個(gè)葉綠素結(jié)合蛋白、2個(gè)泛素結(jié)合酶、1個(gè)