黑曲霉糖化酶淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域的親和性及在馬鈴薯淀粉品質(zhì)改良中應(yīng)用研究.pdf

1、馬鈴薯淀粉具有許多優(yōu)良的特性，它被廣泛應(yīng)用于造紙、食品、膠粘劑和制藥等行業(yè)。但由于在理化性質(zhì)方面的一些局限性，在工業(yè)應(yīng)用中天然淀粉不能很好地發(fā)揮其作用，因此，天然淀粉被利用前通常要用化學(xué)或物理方法進(jìn)行改性處理。天然淀粉的化學(xué)或物理改性的成本昂貴，并且使用的化學(xué)物質(zhì)經(jīng)常是有害的。利用基因工程的方法在植物體內(nèi)對(duì)淀粉的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，可以獲得新的功能淀粉。
　　以前的研究表明，SBD(starch-binding domain，淀粉

2、結(jié)合結(jié)構(gòu)域)-平臺(tái)技術(shù)能有效地將人工構(gòu)建的顆粒結(jié)合型重組蛋白在淀粉生物合成過(guò)程中定位到淀粉顆粒中，從而對(duì)淀粉的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾。在這個(gè)平臺(tái)技術(shù)中，環(huán)狀芽孢桿菌環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)被用作“錨”。黑曲霉糖化酶的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(glucoamylasestarch-binding domain，GASBD)和環(huán)狀芽孢桿菌環(huán)糊精糖基轉(zhuǎn)移酶的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(SBD)同屬于CBM20家族的成員，它們的三維結(jié)構(gòu)和淀粉結(jié)合位點(diǎn)相

3、似。本研究以黑曲霉糖化酶的淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域?yàn)椴牧线M(jìn)行了相關(guān)的研究。主要研究結(jié)果如下:
　　1.串聯(lián)重復(fù)的GASBDs蛋白與淀粉的素和性
　　采用PCR的方法從黑曲霉2316菌株中將糖化酶淀粉結(jié)合結(jié)構(gòu)域(GASBD)的編碼區(qū)擴(kuò)增出來(lái)并進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果(GenBank登錄號(hào)為JQ814697)表明，GASBD基因的編碼區(qū)含有324bp的核苷酸序列，編碼由108個(gè)氨基酸組成的多肽。序列同源性分析表明，GASBD屬于CBM20家族的

4、成員。為了研究人工構(gòu)建的串聯(lián)重復(fù)的GASBDs蛋白在體外與不溶性淀粉的親和力，構(gòu)建了4個(gè)pET28a系列的表達(dá)質(zhì)粒，分別攜帶單個(gè)GASBD基因和2-4個(gè)串聯(lián)重復(fù)的GASBDs基因。通過(guò)Ni2+-NTA親和層析的方法對(duì)在大腸桿菌BL21(DE3)菌株中表達(dá)的重組蛋白GASBD(s)進(jìn)行了純化，并對(duì)純化的重組蛋白GASBD(s)與不溶性淀粉的親和力進(jìn)行了測(cè)定。結(jié)果顯示，GASBD2、GASBD3和GASBD4蛋白與不溶性淀粉的親和力大約是G

5、ASBD蛋白與淀粉親和力的5、8和10倍。這表明，當(dāng)與不溶性淀粉結(jié)合時(shí)GASBDs蛋白中的不同GASBD重復(fù)之間具有協(xié)同增效作用。
　　2.GASBD和GASBD2基因在馬鈴薯中的表達(dá)
　　將單個(gè)GASBD基因或串聯(lián)重復(fù)的GASBD2基因的編碼序列同馬鈴薯顆粒結(jié)合型淀粉合成酶Ⅰ(granule-bound starch synthaseⅠ，GBSSⅠ)的轉(zhuǎn)運(yùn)肽序列融合。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將GASBD基因和GASBD2基因分

6、別轉(zhuǎn)入馬鈴薯栽培品種Desiree中，在馬鈴薯GBSSⅠ啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，它們能在馬鈴薯塊莖中表達(dá)。為了確定GASBD或GASBD2蛋白是否能夠在淀粉生物合成過(guò)程中定位到淀粉顆粒中，用Western斑點(diǎn)雜交的方法對(duì)轉(zhuǎn)基因系淀粉中GASBD或GASBD2重組蛋白的積累量進(jìn)行了分析。結(jié)果表明，GASBD和GASBD2蛋白都能在淀粉顆粒中積累，并且GASBD2蛋白在轉(zhuǎn)基因系淀粉中的最高積累量大約是GASBD蛋白最高積累量的3倍。轉(zhuǎn)基因系薯塊的淀

7、粉含量沒(méi)有變化，這表明GASBD和GASBD2蛋白的表達(dá)對(duì)淀粉的生物合成沒(méi)有影響。此外，對(duì)GASBD或GASBD2蛋白在淀粉顆粒中的積累對(duì)轉(zhuǎn)基因系淀粉的顆粒形態(tài)和理化性質(zhì)的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，GASBD蛋白在淀粉顆粒中的積累對(duì)轉(zhuǎn)基因系淀粉的顆粒形態(tài)沒(méi)有明顯的影響，但GASBD2蛋白在淀粉中的積累對(duì)轉(zhuǎn)基因系淀粉的顆粒形態(tài)有明顯影響。淀粉的其它理化性質(zhì)在轉(zhuǎn)GASBD或GASBD2基因系淀粉與它們的對(duì)照淀粉之間沒(méi)有差異。這些結(jié)果表明，G

8、ASBD和GASBD2可以用于對(duì)淀粉進(jìn)行修飾的SBD-平臺(tái)技術(shù)。
　　3.glgB/GASBD融合基因在馬鈴薯中的表達(dá)
　　以前的研究表明，大腸桿菌糖原分支酶(glycogen branching enzyme，glgB)基因在馬鈴薯塊莖中表達(dá)能導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因系淀粉的分支程度增加。在本研究中，為了得到淀粉分支程度比以前更高的轉(zhuǎn)基因馬鈴薯淀粉，將大腸桿菌glgB基因融合到GASBD基因的5'-端或3'-端。采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法將g

9、lgB/GASBD融合基因和用于對(duì)照的glgB基因分別轉(zhuǎn)入馬鈴薯栽培品種Desiree中，在馬鈴薯GBSSⅠ啟動(dòng)子的驅(qū)動(dòng)下，它們能在馬鈴薯塊莖中表達(dá)。采用Western斑點(diǎn)雜交的方法對(duì)淀粉顆粒中g(shù)lgB/GASBD融合蛋白的積累量進(jìn)行了分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)有大量的glgB/GASBD融合蛋白積累到淀粉顆粒中，并且GASBD在融合蛋白中的位置（在N-末端或在C-末端）對(duì)融合蛋白在淀粉顆粒中的積累沒(méi)有明顯的影響。glgB/GASBD融合基因在馬鈴

10、薯塊莖中表達(dá)導(dǎo)致一些轉(zhuǎn)基因株系的淀粉分支程度與非轉(zhuǎn)基因的對(duì)照淀粉相比增加了35％。但與轉(zhuǎn)glgB基因系的淀粉相比，轉(zhuǎn)glgB/GASBD融合基因系淀粉的分支程度沒(méi)有明顯增加。轉(zhuǎn)基因系薯塊中淀粉含量的測(cè)定結(jié)果表明，glgB/GASBD融合蛋白或glgB蛋白的表達(dá)對(duì)淀粉的生物合成沒(méi)有影響。但glgB/GASBD融合蛋白在淀粉顆粒中的積累導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因系淀粉的顆粒形態(tài)發(fā)生了改變。
　　支鏈淀粉的鏈長(zhǎng)分布的測(cè)定結(jié)果表明，與非轉(zhuǎn)基因的對(duì)照淀粉相

11、比，淀粉分支程度增加的轉(zhuǎn)基因系淀粉的支鏈淀粉分子中含有更多的短鏈，即所謂的A鏈。這可能是轉(zhuǎn)基因系淀粉的分支程度增加的主要原因。對(duì)淀粉分支程度的增加對(duì)轉(zhuǎn)基因系淀粉理化性質(zhì)和功能特性的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果顯示淀粉分支程度的增加導(dǎo)致轉(zhuǎn)基因系淀粉的峰值粘度和回生值降低。與非轉(zhuǎn)基因的對(duì)照淀粉相比，轉(zhuǎn)基因系淀粉的糊化溫度降低了2-3℃，并且淀粉的糊化焓變也降低了。轉(zhuǎn)基因系淀粉的透明度降低而轉(zhuǎn)基因系淀粉的凍融穩(wěn)定性增加。這些結(jié)果表明，淀粉分支程度的增