鯽魚PKR-like Za結(jié)構(gòu)域的表達(dá)及其與核酸親和性分析.pdf

1、PKR是由干擾素(IFN)誘導(dǎo)產(chǎn)生的、依賴雙鏈RNA(dsRNA)激活的蛋白激酶，在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中廣泛存在。鯽魚類PKR基因(CaPKR-like)是第一個(gè)報(bào)道的非哺乳類PKR同源物，其全長(zhǎng)cDNA序列為2192bp，編碼一個(gè)由513個(gè)氨基酸殘基組成的蛋白質(zhì)(CaPKR-like)；CaPKR-likeC-端為典型的激酶催化區(qū)，N-端是功能調(diào)節(jié)區(qū)，但在N-末端沒有哺乳類PKR典型的dsRNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(dsRBM)，取而代之的是兩個(gè)Z-

2、DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(Zα)。 為了進(jìn)一步了解CaPKR-likeN-末端的功能，本文根據(jù)已知序列設(shè)計(jì)引物，從紫外線滅活GCHV誘導(dǎo)的SMART-cDNA文庫(kù)中克隆到了包含Zα結(jié)構(gòu)域的三種cDNA。并經(jīng)原核表達(dá)獲得了包含Zα結(jié)構(gòu)域的三種融合多肽(PZα1、PZα2和PZα1Zα2)，表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)過了親和層析純化。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)表明，PZα1、PZα2及兩者的混合物均不能與雙鏈RNA(PolyI∶C)和DNA結(jié)合，而PZα1Zα2與Pol

3、yI∶C及DNA有明顯的結(jié)合現(xiàn)象；而且隨PZα1Zα2濃度的增加，PolyI∶C在瓊脂糖凝膠電泳中產(chǎn)生的阻滯作用越明顯；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)，PZα1、PZα2和PZα1Zα2在體外均能形成二聚體，但PZα1的二聚化現(xiàn)象相對(duì)較弱。 此外，用純化的PZα1Zα2免疫家兔，制備了多克隆抗體，采用蛋白質(zhì)印跡法(Westernblotting)分析了CaPKR-like在鯽魚各組織及鯽魚囊胚細(xì)胞(CAB)中的表達(dá)情況。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，CaPKR-l