北京油雞胚胎肝臟來源間充質干細胞的分離培養(yǎng)及生物學特性研究.pdf

1、干細胞研究是生命科學研究領域的熱點之一，很多研究成果已應用于臨床實踐中。本研究以中國特有的地方優(yōu)良家禽品種北京油雞為研究對象，對7d雞胚胎肝組織中的間充質干細胞（MSCs）進行體外分離培養(yǎng)，在優(yōu)化的體外培養(yǎng)環(huán)境中細胞傳至25代，凍存156支細胞，應用免疫熒光和RT-PCR技術分別對分離傳代細胞進行鑒定，并對傳代細胞的凍存和復蘇進行探討是否可以通過干細胞凍存保存北京油雞這一珍貴遺傳資源；對分離鑒定的MSCs通過不同的培養(yǎng)條件進行誘導，分別

2、向脂肪細胞、成骨細胞、神經元和心肌細胞進行分化，應用免疫熒光和RT-PCR對誘導分化細胞進行鑒定。
　　結果表明：
　　（1）體外環(huán)境下能夠分離培養(yǎng)北京油雞胎肝來源的間充質干細胞，分離細胞經過多次傳代培養(yǎng)后仍然具有干細胞所特有的增殖和分化潛能，細胞的各項特性符合間充質干細胞的標準。
　?。?）在優(yōu)化組（含10%FBS、5 ng/mL bFGF DMEM/F12培養(yǎng)基）的培養(yǎng)體系下，雞胎肝MSCs體外培養(yǎng)生長旺盛，呈現典

3、型的成纖維細胞形態(tài)，絕大多數細胞呈長梭狀或三角形或不規(guī)則形，細胞排列成漩渦狀或火焰狀，隨著體外培養(yǎng)過程中細胞傳代次數的增加，細胞形態(tài)趨向均一，且低代次細胞增殖較快，高代次細胞生長明顯減慢，隨傳代次數增多老化細胞增加。
　　（3）免疫熒光細胞化學檢測顯示不同代次雞胎肝MSCs的表面標志CD29和CD44均成陽性表達，而CK19和CD34均不表達。RNA轉錄水平RT-PCR檢測鑒定各代次MSCs表面標志CD44、CD29、CD71和C

4、D73均成陽性表達，且灰度分析顯示除了CD73的表達量隨細胞代次的增加而減弱外，其他標志物的表達量差別不顯著。分離培養(yǎng)得到的細胞為間充質干細胞，MSCs在體外傳代培養(yǎng)后仍能維持MSCs的特性。
　　（4）雞胎肝MSCs隨著傳代次數的增加，細胞的凍存及復蘇活率呈下降趨勢，不同代次雞胎肝MSCs的細胞生長曲線呈經典的“S”型，細胞倍增均歷經潛伏期、對數生長期以及生長停滯期。培養(yǎng)的低代次雞胎肝MSCs中所含S期細胞較高，G0/G1期細胞

5、較低，隨細胞傳代次數的升高 G0/G1期比例隨之增高，S期細胞顯著下降。冷凍復蘇細胞培養(yǎng)符合體外細胞培養(yǎng)的生長規(guī)律。
　?。?）雞胎肝MSCs在一定的培養(yǎng)條件下不同代次的細胞均能夠分別向脂肪細胞、成骨細胞、神經元和心肌細胞進行分化，且分化后的細胞在形態(tài)上發(fā)生了相應的變化，少部分細胞出現死亡；隨著細胞代次的增高細胞的分化能力減弱，高代次分化后的細胞老化明顯；實驗分別通過相對應染色方法對分化后細胞進行了物理檢測檢驗分化效果，并通過 R

6、T-PCR進一步檢測了 PPAR-γ、LPL，Collage typeⅠ、Osteopontin， Nestin、NF和 Desmin、MyoD1這四種細胞各兩種標志物，并分析了分化的目的細胞標志物的表達量變化規(guī)律，證明高代次的細胞相較于低代次的細胞分化細胞標志物均出現表達量下調的趨勢，說明低代次的細胞在體外更易被誘導分化，細胞隨傳代次數的增加，細胞的分化能力在減弱。實驗證明由7d雞胚胎肝所分離的MSCs為多潛能間充質干類型的干細胞。<