人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及免疫抑制作用比較.pdf

1、異基因造血干細(xì)胞移植(allogeneic hemotoic stem cell transplantation，allo-HSCT)是治療各種血液系統(tǒng)惡性腫瘤、重型再生障礙性貧血及重癥地中海貧血等的有效治療方法，但移植相關(guān)并發(fā)癥仍是威脅患者生命的重要因素，其中移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)是移植后最嚴(yán)重最棘手的并發(fā)癥之一，急性移植物抗宿主病(aGVHD)是移植后患者非復(fù)發(fā)死亡的主要原因，

2、其發(fā)生必須具備三個(gè)前提:①移植物中含有足夠數(shù)量的識(shí)別和攻擊宿主異源性抗原的免疫活性細(xì)胞;②宿主應(yīng)有與移植物不同的同種異體抗原;③宿主處于免疫無(wú)能狀態(tài)，對(duì)移植物不產(chǎn)生排斥。目前根據(jù)GVHD發(fā)病機(jī)制的不同，各種抗GVHD的化學(xué)藥物在臨床上廣泛應(yīng)用，如人抗胸腺球蛋白(anti-humanthymocyte globulin，ATG)、抗TNF抗體英夫利昔、環(huán)孢素A(CsA)、他克莫司(FK506)等，但這些非特異性免疫抑制藥物本身具有毒副作用

3、且易導(dǎo)致病毒及真菌等感染，從而影響療效。如何降低allo-HSCT患者移植相關(guān)死亡率、提高患者生存率及生存質(zhì)量，是目前臨床工作面臨的挑戰(zhàn)。
　　間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cell，MSC)作為中胚層來(lái)源的具有多向分化潛能的多能干細(xì)胞，MSC在體外可誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等多種組織細(xì)胞，其經(jīng)過(guò)多次傳代培養(yǎng)、凍存復(fù)蘇后仍具有多向分化潛能。且MSC具有造血支持、低免疫原性、免疫抑制及無(wú)致瘤

4、性等特點(diǎn)，近年來(lái)，隨著細(xì)胞替代治療與組織工程學(xué)的不斷發(fā)展，MSC已被應(yīng)用于自身免疫性疾病、神經(jīng)系統(tǒng)損傷、阿爾茲海默病、心血管疾病等多種疾病的治療研究，在血液學(xué)方面，已被應(yīng)用于GVHD的預(yù)防和治療。目前骨髓仍是MSC的主要來(lái)源，在血液系統(tǒng)疾病方面，人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(human bone marrowmesenchymal stem cell，hBMSC)已被應(yīng)用于臨床治療GVHD，但成人hBMSC細(xì)胞數(shù)量極少，并且增殖分化潛能隨年齡的增

5、大而下降，病毒感染率較高，供者h(yuǎn)BMSC的采集須行有創(chuàng)性骨髓穿刺，亦使其來(lái)源受到限制。
　　引起aGVHD發(fā)生、發(fā)展的主要細(xì)胞為免疫活性細(xì)胞，即供者來(lái)源的成熟T淋巴細(xì)胞在患者體內(nèi)的活化，可引起其一系列的反應(yīng)，繼而激活并產(chǎn)生IL-2、IFN-γ、TNF-α、IL-12及其受體等。其中IL-2和IFN-γ為Th1細(xì)胞因子，Th1細(xì)胞介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答，在遲發(fā)型超敏反應(yīng)、部分自身免疫性疾病、宿主體內(nèi)抗胞內(nèi)病原感染都起著重要作用，Th1細(xì)胞

6、與aGVHD的發(fā)生發(fā)展也有密切關(guān)系。而我們知道，hAMSC具有免疫抑制作用，而且其低表達(dá)HLA-ABC和HLA-G，不表達(dá)HLA-DR表面抗原，表現(xiàn)出低免疫源性和免疫抑制作用，且移植到動(dòng)物體內(nèi)無(wú)致瘤性，是較為理想的免疫赦免細(xì)胞，為各種疾病的細(xì)胞治療提供了新的選擇。在異基因造血干細(xì)胞移植中，如何平衡機(jī)體內(nèi)Th1/Th2細(xì)胞及Ⅰ/Ⅱ型細(xì)胞因子，對(duì)于預(yù)防和治療GVHD具有重要意義。由此可見，人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞可能為GVHD治療新的種子細(xì)胞，具

7、有潛在的臨床應(yīng)用價(jià)值。
　　已有研究報(bào)道間充質(zhì)干細(xì)胞幾乎存在于所有的組織器官中，且不同組織來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞，其體外擴(kuò)增的能力也不完全相同。已有研究報(bào)道了臍帶及胎肺來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞與骨髓來(lái)源的間充質(zhì)干細(xì)胞相比，前者的體外擴(kuò)增能力明顯強(qiáng)于后者，前者可在傳代40多次后仍保持原有的生物學(xué)特性及增殖能力。因此，目前越來(lái)越多的研究組致力于尋找新的間充質(zhì)干細(xì)胞，希望能夠替代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在臨床中的應(yīng)用，以解決骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源不足的問(wèn)題

8、。2004年研究者首次從人羊膜分離出間充質(zhì)干細(xì)胞，經(jīng)鑒定后發(fā)現(xiàn)其從羊膜中胚層分化而來(lái)，具有向三胚層分化的多潛能性，人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(humanamniotic mesenchymal stem cells，hAMSC)從健康產(chǎn)婦正常分娩后廢棄的胎盤組織中分離培養(yǎng)，羊膜組織來(lái)源充足，系產(chǎn)后廢棄物、不受倫理學(xué)限制，且羊膜不含有血管、神經(jīng)、肌肉等組織，分離提純過(guò)程相對(duì)簡(jiǎn)單、分離細(xì)胞純度較高。經(jīng)免疫表型鑒定，hAMSC不僅表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表

9、面抗原，還表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)表面抗原，如Oct-3、Oct-4、SSEA-3、SSEA-4等，這提示hAMSC可能還具有干細(xì)胞特性。近年來(lái)，人羊膜干細(xì)胞已經(jīng)在角膜修復(fù)、燒傷性疾病、骨科疾病、脊髓損傷等相關(guān)疾病的臨床研究和治療取得療效。那么，hAMSC與hBMSC生物學(xué)特性相似，均具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性，且hAMSC可能還具有干細(xì)胞特性，細(xì)胞來(lái)源更豐富，是否可成為hBMSC的替代治療用于GVHD的預(yù)防和治療呢？
　　目的：
　　本實(shí)

10、驗(yàn)通過(guò)對(duì)hAMSC和hBMSC生物學(xué)特性及對(duì)異體外周血淋巴細(xì)胞的免疫抑制功能的比較，希望為hAMSC治療GVHD、解決hBMSC來(lái)源不足的問(wèn)題提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　通過(guò)酶消化法從健康剖宮產(chǎn)產(chǎn)婦志愿捐獻(xiàn)的新鮮胎盤羊膜中分離培養(yǎng)hAMSC，通過(guò)密度梯度離心法從健康供者志愿捐獻(xiàn)的骨髓中分離培養(yǎng)hBMSC。實(shí)驗(yàn)分為兩部分:第一部分實(shí)驗(yàn)為hAMSC與hBMSC生物學(xué)特性的比較，分別培養(yǎng)相同傳代代數(shù)的人羊膜來(lái)源與骨髓來(lái)源的MS

11、C，對(duì)二者進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察，通過(guò)CCK-8法檢測(cè)兩種細(xì)胞的增殖情況并生長(zhǎng)曲線繪制，對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞周期檢測(cè)，采用流式免疫分型技術(shù)分別對(duì)兩種細(xì)胞進(jìn)行免疫表型鑒定，采用免疫熒光技術(shù)檢測(cè)兩種細(xì)胞的波形蛋白(vimentin);第二部分實(shí)驗(yàn)為hAMSC和hBMSC對(duì)異體外周血淋巴細(xì)胞的免疫抑制功能的比較，經(jīng)絲裂霉素處理后的hAMSC與hBMSC分別與植物血凝集素(phytohemagglutinin，PHA)刺激的異體人淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)，分別

12、建立MSC與異體人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)共培養(yǎng)體系，采用CCK-8法比較兩種不同共培養(yǎng)體系中淋巴細(xì)胞的增殖情況，采用ELISA法比較兩種不同共培養(yǎng)體系中細(xì)胞因子干擾素-γ(IFN-γ)的分泌水平。
　　結(jié)果：
　　(1)hAMSC與hBMSC細(xì)胞形態(tài)相似，hAMSC可傳至15代以上，hBMSC傳至第6-7代細(xì)胞后，開始老化、生長(zhǎng)增殖能力明顯減弱;
　　(2)在細(xì)胞周期的比較中，hAMSC與hBMSC二者的G2/M

13、期細(xì)胞比例差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);
　　(3)細(xì)胞免疫表型鑒定，hAMSC和hBMSC細(xì)胞表面均表達(dá)CD105、CD90、CD73，均不表達(dá)CD34、CD45、CD11b、CD19、HLA-DR，hAMSC表達(dá)Oct-3/4，而hBMSC不表達(dá)Oct-3/4;
　　(4)免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，hAMSC與hBMSC均表達(dá)vimentin;
　　(5)hAMSC和hBMSC均對(duì)PHA刺激的PBMC增殖具有抑制作

14、用，且隨著hAMSC和hBMSC細(xì)胞比例的增高，抑制能力增強(qiáng)，二者無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05);
　　(6)ELISA結(jié)果提示，hAMSC+PBMC+PHA共培養(yǎng)組上清中IFN-γ水平較hBMSC+PHA+PBMC組低(P=0.056)，而hAMSC+PBMC+PHA共培養(yǎng)組及hBMSC+PHA+PBMC共培養(yǎng)組分別與PBMC+PHA組上清比較，IFN-γ水平明顯降低(P＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　hAMSC比hB