L-谷氨酰胺生產(chǎn)菌的定向改造.pdf

1、L-谷氨酰胺在生命活動(dòng)中具有重要作用，已被廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥等諸多領(lǐng)域。隨著市場需求的不斷增大，提高谷氨酰胺的生產(chǎn)效率顯得至關(guān)重要，而代謝途徑的優(yōu)化可能對生產(chǎn)效率的提高起到非常重要的作用。
　　本文以L-谷氨酰胺生產(chǎn)菌Corynebacterium glutamicum GM34為出發(fā)菌，以提高谷氨酰胺的產(chǎn)量、減少副產(chǎn)物谷氨酸產(chǎn)量和構(gòu)建溫敏型谷氨酰胺生產(chǎn)菌為目標(biāo)，對C.glutamicum GM34進(jìn)行了一系列分子改造。主要研究

2、內(nèi)容和結(jié)果如下:
　　(1)NCgl1221基因編碼的蛋白是重要的谷氨酸分泌載體，為了研究NCgl1221基因缺失對副產(chǎn)物谷氨酸積累的影響，采用同源重組技術(shù)敲除了谷氨酰胺生產(chǎn)菌GM34的NCgl1221基因，構(gòu)建了菌株GM34△NCgl1221。在5L發(fā)酵罐上進(jìn)行了分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果菌株GM34△NCgl1221的谷氨酸積累量為0.17(g/g DCW)，比出發(fā)菌降低了19.1％，而谷氨酰胺的積累量未見明顯變化。
　　(

3、2)丙酮酸羧化酶(pyruvate carboxylase，Pc，由pyc基因編碼)在谷氨酸棒桿菌的回補(bǔ)途徑中有重要作用。利用穿梭質(zhì)粒pXMJ19構(gòu)建了pyc基因過表達(dá)菌株GM34pXMJ19pyc。5L發(fā)酵罐分批補(bǔ)料發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，過表達(dá)pyc基因使菌體生長速度得到了提升，谷氨酰胺產(chǎn)量為3.3(g/gDCW)，比對照組提高了5.5％。
　　(3)溫度敏感突變株相比現(xiàn)有的生物素缺陷菌株具有非常多的優(yōu)點(diǎn)。ltsA基因的突變可以使某

4、些谷氨酸棒桿菌菌株轉(zhuǎn)變?yōu)闇囟让舾芯?。利用整合載體pK18mobsacB，通過同源重組技術(shù)敲除了谷氨酰胺生產(chǎn)菌GM34的ltsA基因，構(gòu)建了菌株GM34△ltsA。培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)GM34△ltsA38℃下仍能生長。在5L發(fā)酵罐上進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)溫度轉(zhuǎn)換不能誘導(dǎo)L-谷氨酰胺分泌。說明ltsA基因缺失不能使GM34轉(zhuǎn)變?yōu)闇囟让舾型蛔冎?，這為以后的進(jìn)一步改造提供了一定的借鑒。
　　(4)PH控制對谷氨酰胺發(fā)酵有重要影響。發(fā)酵20h左右，發(fā)酵