L-谷氨酰胺產(chǎn)生菌選育及其代謝調(diào)控的初步研究.pdf

1、L-谷氨酰胺(L-Glutamine)是L-谷氨酸γ-羧基酰胺化的一種氨基酸，具有許多特殊的功能，被歸類為條件必需氨基酸。目前國內(nèi)外臨床上主要將它應(yīng)用于治療精神萎靡、酒精中毒及胃和十二指腸潰瘍等疾病。另外它還具有增進神經(jīng)機能，改善腦出血后的記憶障礙，促進智力不佳兒童的智力發(fā)展，防止癲癇發(fā)作等功能，是一種極有發(fā)展前途的新藥。本文主要從L-谷氨酰胺產(chǎn)生菌的選育和發(fā)酵條件優(yōu)化，育種的代謝流分析，以及谷氨酰胺合成酶調(diào)節(jié)四方面入手進行了研究。主要

2、研究內(nèi)容及結(jié)果如下：
　　 ⑴根據(jù)代謝控制育種的原理，系統(tǒng)地研究了L-谷氨酰胺產(chǎn)生菌的選育。以實驗室保藏菌株嗜乙酰乙酸棒桿菌YL012(MSOR)為出發(fā)菌株，采用UV和NTG誘變處理，采用磺胺胍、硫酸銨和氟化納三種藥物平板，及以琥珀酸為唯一碳源的平板進行定向篩選，最后獲得一株L-谷氨酰胺產(chǎn)生菌LCHA082(MSOR，SGR，(NH4)2SO4R，SAG，NaFR)。在未經(jīng)優(yōu)化的條件下發(fā)酵液中可積累L-谷氨酰胺35.8 g/L，

3、比出發(fā)菌株產(chǎn)量提高了9.4 g/L。
　　 ⑵對誘變后菌株LCHA082的發(fā)酵培養(yǎng)基進行了優(yōu)化以及對其發(fā)酵條件的研究，最后得出了發(fā)酵培養(yǎng)基的最佳組成:葡萄糖130.2，硫酸銨58.7，玉米漿2.78，碳酸鈣25， KH2PO41.25， MgSO4·7H2O0.6， MnSO4·4H2O0.003， FeSO4·7H2O0.005， ZnSO4·7H2O0.006；最佳培養(yǎng)條件為:發(fā)酵液培養(yǎng)基初始pH為7.5，接種量為8%，裝液

4、量為250mL三角瓶裝15 mL發(fā)酵培養(yǎng)基，30℃，100 r/min，72 h。產(chǎn)酸穩(wěn)定在40.7 g/L，最高產(chǎn)量42.4 g/L，比未經(jīng)優(yōu)化提高了5.9 g/L。
　　 ⑶對出發(fā)菌株YL012和突變株LCHA082進行了代謝流量分析，建立并完善了嗜乙酰乙酸棒桿菌YL012及其突變株LCHA082合成L-谷氨酰胺的中心代謝網(wǎng)絡(luò)，代謝分析發(fā)現(xiàn)流入谷氨酸節(jié)點的流量由29.198上升到44.854，提高到原來的1.5倍左右，其中流

5、入目的產(chǎn)物谷氨酰胺的流量由18.138上升至31.065最為明顯:并且通過各個節(jié)點的代謝流量對比，為下一步的育種設(shè)計提供了參考。
　　 ⑷通過氮饑餓的方法對谷氨酰胺合成酶(GS)進行調(diào)節(jié)，并對原位氮饑餓-梯度補氮的方法進行了初步的研究。確定了原位氮饑餓的條件為:氮饑餓初氮為尿素2.0 g/L，補料氮源為(NH4)2SO4(20%)，氮饑餓時間為15 h，補氮方式為:梯度補加四次。四次補料濃度分別為:5 g/L，10 g/L，25