無細胞體系高效合成復(fù)雜膜蛋白的關(guān)鍵技術(shù)及工業(yè)應(yīng)用探索.pdf

1、膜蛋白由于具有極其重要的生物學(xué)和醫(yī)學(xué)意義，其研究已經(jīng)成為蛋白質(zhì)科學(xué)、結(jié)構(gòu)生物學(xué)以及醫(yī)學(xué)藥學(xué)領(lǐng)域的重要部分，同時也是仿生膜等工程領(lǐng)域的研究基礎(chǔ)。膜蛋白有不同的分類方法，既包括一次跨膜結(jié)構(gòu)的簡單膜蛋白，又包括多次跨膜的復(fù)雜膜蛋白。復(fù)雜膜蛋白包括受體蛋白，離子通道蛋白，轉(zhuǎn)運蛋白，催化膜上反應(yīng)的酶等具有各種生物學(xué)功能的蛋白質(zhì)，其結(jié)構(gòu)和功能研究關(guān)系著生命科學(xué)的各個方面。然而，膜蛋白尤其是復(fù)雜膜蛋白的大量制備仍然是現(xiàn)有體內(nèi)蛋白表達技術(shù)難以攻克的難關(guān)

2、之一。無細胞蛋白合成體系則為體內(nèi)難以表達的膜蛋白研究提供了嶄新的思路。
　　本文選取線蟲嗅覺受體ODR-10為目標開展了G蛋白偶聯(lián)受體(GPCR)在無細胞系統(tǒng)高效表達的研究。GPCR是膜蛋白的一個重要組成部分，是許多藥物篩選的靶點。本文采取了添加去污劑和脂質(zhì)體兩種策略在大腸桿菌無細胞體系實現(xiàn)ODR-10蛋白的可溶表達，可溶性O(shè)DR-10的表達水平達到100μg/mL以上。添加脂質(zhì)體的策略促進了受體蛋白更加正確的折疊，同時可以使嗅覺

3、受體在原位被合成、折疊和重構(gòu)，這將方便嗅覺受體蛋白的結(jié)構(gòu)和功能研究，為嗅覺傳感器的制備提供支持。
　　在實現(xiàn)受體蛋白大量可溶表達的基礎(chǔ)上，本文進一步研究了通道蛋白的大量制備。選取了大腸桿菌水通道蛋白AqpZ為目標蛋白，利用大腸桿菌無細胞體系高效表達，并采取Ni2+親和層析純化得到目標蛋白。純化后的AqpZ成功嵌入到脂質(zhì)體上，并證實了功能活性。采用信號肽策略使AqpZ在無細胞體系的表達水平進一步提高。通過在無細胞體系中添加一定濃度的

4、去污劑或脂質(zhì)體可以原位切除信號肽，簡化了純化步驟，得到了天然大小的具有功能活性的AqpZ。該策略使得在一個反應(yīng)器中能同時完成轉(zhuǎn)錄翻譯、信號肽切除、膜蛋白正確折疊的過程。
　　膜蛋白有許多有前景的工業(yè)應(yīng)用，例如各種仿生膜的制備。在得到大量AqpZ的前提下，選取AqpZ進行了水通道過濾芯片的制備探索。本文制備了納米氧化鋁支撐的雙分子膜，并合成了兩親性雙嵌段聚合物PMOXA-PDMS-PMOXA，研究了其與AqpZ的相互作用。結(jié)果證明聚

5、合物更適于制備穩(wěn)定的固體支撐膜，用于海水淡化或者廢水回收。
　　許多膜蛋白都具有糖鏈，大部分有醫(yī)學(xué)應(yīng)用前景的蛋白質(zhì)也都是糖蛋白。如何實現(xiàn)糖蛋白的高效異源表達也是膜蛋白大量制備需要解決的問題。本文探索了酵母無細胞蛋白合成體系的制備，發(fā)明了一種簡便易行的酵母無細胞表達體系。該體系細胞容易培養(yǎng)，成本廉價，制備工藝簡單，與其他真核體系相比具有一定優(yōu)勢。通過代謝改造可能會使酵母無細胞系統(tǒng)表達的異源糖蛋白更接近藥物蛋白的要求。
　　總之