馬奶酒樣乳桿菌ZW3(CGMCC2809)WANG_1297基因的克隆、表達(dá)與功能研究.pdf

1、乳酸菌是公認(rèn)安全的食品級(jí)微生物，胞外多糖(EPS)是其重要的次生代謝產(chǎn)物，研究發(fā)現(xiàn)，乳酸菌胞外多糖有很多保健功能。乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量一般來說都比較低，限制了其工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用，如何提高乳酸菌胞外多糖產(chǎn)量是國(guó)內(nèi)外研究的一個(gè)熱點(diǎn)，而對(duì)于產(chǎn)糖機(jī)理的研究正是提高胞外多糖產(chǎn)量的關(guān)鍵。
　　本實(shí)驗(yàn)室對(duì)馬奶酒樣乳桿菌ZW3進(jìn)行了全基因組測(cè)序工作，分析得到一段14.4kb的胞外多糖合成基因簇，包含17個(gè)與胞外多糖合成相關(guān)的基因WANG_1283～

2、WANG_1299，分別編碼多糖合成調(diào)節(jié)基因、聚合基因、糖基轉(zhuǎn)移酶基因等。通過半定量RT-PCR實(shí)驗(yàn)，對(duì)EPS基因簇各基因的表達(dá)量進(jìn)行分析，得出以下結(jié)果。
　　WANG_1283、WANG_1285、WANG_1293三個(gè)基因在選取的六個(gè)時(shí)間點(diǎn)表達(dá)量變化不大;WANG_1284、WANG_1286、WANG_1287、WANG_1288、WANG_1290、WANG_1291、WANG_1292、WANG_1294、WANG_12

3、96、WANG_1297、WANG_1298、WANG_1299這十二個(gè)基因在菌體生長(zhǎng)的50h、60 h（產(chǎn)糖量上升階段）表達(dá)量最高，推測(cè)這些基因在多糖聚合過程中起作用;基因WANG_1289隨著菌體生長(zhǎng)時(shí)間表達(dá)量持續(xù)升高，在菌體生長(zhǎng)的80 h（產(chǎn)糖后期）表達(dá)量最高，推測(cè)其在胞外多糖合成后期起作用;基因WANG_1295在開始10h即有大量表達(dá)，30h有所下降，到50～72h表達(dá)量維持在較高水平，到80 h又有所下降，呈現(xiàn)出表達(dá)量的高低

4、變化。
　　本實(shí)驗(yàn)從EPS基因簇中選取一個(gè)在菌體生長(zhǎng)過程中表達(dá)量變化明顯的基因WANG_1297作為研究對(duì)象，深入探討WANG_1297基因在胞外多糖合成中的功能。生物信息學(xué)分析表明，WANG_1297編碼的蛋白屬于Fer4_NifH蛋白超家族，具有ATP結(jié)合結(jié)構(gòu)域，同時(shí)還有eps_fam多功能位點(diǎn)，這些基因位點(diǎn)與莢膜多糖的生物合成相關(guān)，跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明，該基因編碼蛋白為胞內(nèi)蛋白;通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR實(shí)驗(yàn)，得出其在多糖合成旺盛階