土著浸礦微生物群落引種機(jī)制研究.pdf

1、在生物冶金領(lǐng)域，為了構(gòu)建和優(yōu)化浸礦微生物群落，常常需要引入具有一定特性的嗜酸微生物。關(guān)于土著浸礦微生物群落引種機(jī)制的研究還沒有相關(guān)報(bào)道。本文利用構(gòu)建的共培養(yǎng)體系或馴化后的自然嗜酸微生物群落作為土著群落，在其不同的生長(zhǎng)時(shí)期，引入不同代謝類型的外來浸礦菌種。對(duì)土著浸礦微生物群落的引種機(jī)制進(jìn)行了研究，為找出浸礦過程中對(duì)土著群落引種的最佳類型和時(shí)間提供理論依據(jù)。
　　 采用液體梯度稀釋分離法從不同酸性礦坑水樣品中分離到4株弧狀或螺旋狀菌

2、株。對(duì)四株分離物的純度、生理特征、16S rDNA和gyrB基因序列、形態(tài)學(xué)以及對(duì)黃鐵礦浸出能力的分析后，最終確定四株分離物均為嗜鐵鉤端螺旋菌（L.ferriphilum）。
　　 構(gòu)建了一個(gè)包括At.caldus、L.ferriphilum、Ferroplasma、At.errooxidans、Acidiphillum spp.和S.thermosulfidooxidans的共培養(yǎng)體系，其在40℃、pH為1.5和礦漿濃度為0.

3、5％(g/100ml)時(shí)對(duì)黃鐵礦的浸出效率相對(duì)較好;在此條件下， At.caldus、L.ferriphilum和Ferroplasma為共培養(yǎng)體系中的優(yōu)勢(shì)種群，而At.ferrooxidans、Acidiphillum spp.和S.thermosulfidooxidans為劣勢(shì)種群;其各個(gè)生長(zhǎng)時(shí)期可劃分為:0-48小時(shí)為生長(zhǎng)適應(yīng)期;48-96小時(shí)為快速生長(zhǎng)期;96-192小時(shí)為穩(wěn)定生長(zhǎng)期;192-240小時(shí)為衰亡期。
　　

4、以上述共培養(yǎng)體系作為土著群落，At.thiooxidans A01作為外來菌種分別在第66和138小時(shí)引入土著群落后，對(duì)黃鐵礦浸出效率分別提高了10％和13％。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示:At.thiooxidans A01的引入促進(jìn)L.ferriphilum、Ferroplasma和Acidiphillum spp.的生長(zhǎng);在一定程度上抑制At.caldus的生長(zhǎng);而對(duì)At.ferrooxidans和S.thermosulfidooxid

5、ans的影響不大。功能基因芯片結(jié)果表明:來自L.erriphilum的編碼protoheme ferrolyase、ormate hydrogenlyase、ADPheptose、phosphoheptose isomerase和glycosyltransf erase的基因，以及來自Ferroplasma sp.的編碼ferredoxin oxidoreductase的基因和來自Acidiphillum spp.編碼acetyl-Co

6、A carboxylase的基因，在引種后0-20小時(shí)表達(dá)水平上調(diào);來自At.caldus的doxD基因和來自S.thermosulfidooxidans編碼 ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase的基因，在引種后0-20小時(shí)表達(dá)水平都下調(diào);來自At.ferrooxidans編碼ADP-heptose Synthase的基因在引種后0-12小時(shí)表達(dá)水平上調(diào)，而在12-20小時(shí)下調(diào)。

7、
　　 對(duì)上述共培養(yǎng)體系的組分進(jìn)行微調(diào)(At.thiooxidans A01加入，而L.ferriphilum YSK移除，其他組分不變)，在相同實(shí)驗(yàn)條件下，L.ferriphilum YSK作為外來菌種分別在第0、66和138小時(shí)引入后，對(duì)黃鐵礦的浸出效率分別提高了9％、14％和19％。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示:L.ferriphilum YSK引入后，促進(jìn)At.caldus、At.thiooxidans和Acidiphillu

8、m spp.的生長(zhǎng);抑制Ferroplasma和S.thermosulfidooxidans的生長(zhǎng);而對(duì)At.ferrooxidans的影響不大。運(yùn)用功能基因芯片對(duì)第138小時(shí)引種后功能基因表達(dá)水平的變化進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn):來自L.ferriphilum的編碼ADP heptose、phosphoheptose isomerase、glycosyltransferase、Biotin carboxylase和protoheme ferrol

9、yase的基因，以及來自Acidiphillum spp.編碼acetyl-CoA carboxylase的基因和來自At.caldus的doxD基因，在引種后0-20小時(shí)表達(dá)水平上調(diào);來自At.ferrooxidans編碼lipid A disaccharide synthase LpxB、glycosyltransferase和ADP-heptose Synthase的基因，在引種后0-8小時(shí)表達(dá)水平上調(diào)，而在8-20小時(shí)下調(diào);來自

10、Ferroplasma sp.的編碼ferredoxinoxidoreductase的基因在引種后0-4小時(shí)表達(dá)水平上調(diào)，而4-16小時(shí)下調(diào)，16-20小時(shí)上調(diào);來自At.ferrooxidans的CbbS基因，在引種后0-20小時(shí)表達(dá)水平下調(diào)。
　　 對(duì)來自不同酸性礦坑水中的嗜酸微生物混合，在低品位黃銅礦的浸礦體系中經(jīng)過連續(xù)五次馴化后，其對(duì)黃銅礦的浸出效率提高了近45％。RFLP結(jié)果顯示:馴化前的群落中共檢測(cè)到八種常見浸礦微生

11、物，包括At.ferrooxidans, At.caldus，Sulfobacillus sp.，L.ferriphilum,S.thermosulfidooxidans, Acidiphilium sp., Alicyclobacillus sp.和Pseudomonas sp.;而在馴化后的群落中，只檢測(cè)到了At.ferrooxidan，At.caldus, Sulfobacillus sp.，L.ferriphilum和Acidi

12、philium的存在。功能基因芯片結(jié)果表明:At.caldus、L.ferriphilum、Sulfobacillus sp.、Sulfolobus sp.和Acidiphilium sp.在群落中的豐度隨著馴化而逐漸增多;而S.thermosulfidooxidans、Alicyclobacillus sp.和At.ferrooxidans的豐度逐漸減少。來自At.caldus和Sulfolobus sp.的與硫代謝相關(guān)的功能基因的豐

13、度逐漸增多，而來自At.ferrooxidans的與硫代謝相關(guān)的功能基因的豐度逐漸減少;來自L.ferriphilum的與鐵代謝相關(guān)的編碼protoheme ferrolyase的基因的豐度逐漸增加;來自At.ferrooxidans, At.caldus,L.ferriphilum, Sulfolobus spp.和Acidiphilium sp.的與金屬抗性相關(guān)的功能基因的豐度逐漸增加。
　　 以上述從酸性礦坑水中馴化所得群

14、落作為土著群落，At.thiooxidans A01作為外來菌種分別在第0、24和36天引入（浸礦周期為48天）。結(jié)果表明:在沒有引種，以及第0、24和36天引種的各個(gè)浸礦體系中，最終Cu2+浸出濃度依次為:204.3、215.1、230.8和251.5 mg/1。運(yùn)用RFLP方法對(duì)在第36天引種后的土著群落進(jìn)行分析后發(fā)現(xiàn):在引種前第36天和引種后第48天的群落中，雖然同時(shí)檢測(cè)到L.ferriphilum,At.ferrooxidans

15、,At.caldus, Sulfobacillus sp.,At.albertensis和Acidiphilium的存在，但優(yōu)勢(shì)種群At.caldus、L.ferriphilum和At.ferrooxidans在群落中所占比例分別由38.4％、30.4％和17.6％相應(yīng)變化為29.6％、40％和12％。而在沒有引種的第48天的對(duì)照組中，我們只檢測(cè)到了除At.albertensis外的其他5個(gè)種群，且At.caldus、L.ferriph

16、ilum和At.ferrooxidans的比例為43.2％、36％和10.4％。實(shí)時(shí)定量PCR和功能基因芯片結(jié)果顯示: At.thiooxidans A01在第36天引入后首先主要吸附在礦石表面，并在第42天吸附量達(dá)到最大值，隨后逐漸下降;而浮游的At.thiooxidans A01開始時(shí)菌體濃度較低，直到第45天才達(dá)到最大值，隨后逐漸下降。吸附和浮游的At.caldus和Sulfobacillus sp.在引種后的群落中的豐度都相對(duì)下

17、降;而L.ferriphilum、At.ferrooxidans和Acidiphilium sp.都相對(duì)上升。來自L.ferriphilum的編碼protoheme ferrolyase和來自At.ferrooxidans的編碼sulfide-quinone reductase的基因的豐度不管是在吸附還是浮游樣品中，在引種后的群落中都顯著增加;相反，來自At.caldus和Sulfolobus sp.的與硫代謝相關(guān)的一些基因（如doxD