微生物合成γ-聚谷氨酸及其分子生物學(xué)研究.pdf

1、生物可降解材料、藥物靶向和緩釋材料等可供選擇的種類，難以滿足日益發(fā)展的環(huán)境保護(hù)和藥物治療的需要。γ-聚谷氨酸(γ-PGA)因其良好的水溶性、生物降解性、生物相容性和安全無毒性，以及分子鏈上具有的高活性側(cè)鏈羧基，易于發(fā)生交聯(lián)、螯合和衍生化，在醫(yī)藥、食品、化妝品和農(nóng)業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的發(fā)展前景和巨大的開發(fā)潛力。目前，亟需解決的是如何提高單位產(chǎn)量以降低成本，并實現(xiàn)對單體組成和分子量的可控性，這就要求從γ-PGA的生物合成途徑進(jìn)行深入研究。

2、　　 本研究從發(fā)酵食品中分離到4株谷氨酸依賴型和1株非谷氨酸依賴型γ-PGA合成菌，通過16S rRNA和BIOLOG初步鑒定為：Bacillus licheniformis CDL-1，B．subtilis CDL-2，B．subtilis CDL-16，B．subtilis CDL-17和B．subbtilis CDL-19。利用紫外光譜掃描、TLC、1H-NMR、RT-HPLC和GPC等技術(shù)對發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行鑒定和分析，結(jié)果表明5株

3、菌合成的γ-PGA產(chǎn)物中D-谷氨酸含量在5.80％～33.95％之間，重均分子量Mw為347 kD～443 kD，分散度為1.19～1.44。低D-谷氨酸單體含量、低分子量和分子量分布小的γ-PGA在醫(yī)藥、化妝品和食品領(lǐng)域具有很大應(yīng)用價值。
　　 本研究利用分子微生物學(xué)手段，對本室的谷氨酸依賴型B．licheniformisNK-03和谷氨酸非依賴型γ-PGA合成菌Bacillus sp.LL3產(chǎn)γ-PGA進(jìn)行了深入研究。首先，

4、采用特異性細(xì)菌促旋酶基因gyrA，將Bacillus sp.LL3進(jìn)一步鑒定為B．a(chǎn)myloliquefaciens LL3，并首次克隆獲得其γ-PGA合成酶基因pgsBCA。通過與B．a(chǎn)myloliquefaciens FZB42、B．subtilis168、B．licheniformis ATCC14580、B．pumilus SAFR-032等標(biāo)準(zhǔn)菌株的PgsBCA氨基酸序列比對發(fā)現(xiàn)，PgsB和PgsC具有94.35和94.09%

5、高度同源性，而PgsA差異性較大，只有79.85%-致性。設(shè)計含有pgsBCA基因的表達(dá)載體pTrcpgs，以及pgsBCA、谷氨酸消旋酶基因racE的雙基因重組載體pTrcRP，分別在E.coli JM109進(jìn)行表達(dá)。在以葡萄糖或L-谷氨酸作為底物的LB(含Mg2+和Mn2+)培養(yǎng)基進(jìn)行發(fā)酵，結(jié)果顯示L-谷氨酸相對于葡萄糖為更好的底物，含LL3 pgsBCA的重組菌其γ-PGA產(chǎn)量高于NK-03，推測來源于LL3的PgsBCA比NK-

6、03催化能力要強(qiáng)，較強(qiáng)的催化能力要求更多的L-谷氨酸底物供應(yīng)；當(dāng)培養(yǎng)基中提供足夠的L谷氨酸時，聚合酶催化合成的γ-PGA差距明顯縮小，這表明足量的底物供應(yīng)可能比合成酶催化能力對高產(chǎn)γ-PGA更為重要，PgsBCA可能不是γ-PGA合成菌分型的決定因素。另外，通過穿梭載體pXMJ19將NK-03菌株的pgsBCA基因以原生質(zhì)體方法轉(zhuǎn)化谷氨酸棒桿菌C.glutamicum ATCC13032，在C.glutamicum生產(chǎn)L-谷氨酸的培養(yǎng)基

7、中加入IPTG誘導(dǎo)后，可以合成產(chǎn)量為0.69 g/L、重均分子量（Mw）為73071、D-谷氨酸單體占3%的γ-PGA，實現(xiàn)了γ-PGA以糖類為底物的“一步法”合成。
　　 以正交設(shè)計方法對B．a(chǎn)myloliquefaciens LL3發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA的培養(yǎng)基配方進(jìn)行優(yōu)化。分析結(jié)果表明，蔗糖對試驗組影響最大、為最顯著因子，最優(yōu)組合為蔗糖50 g/L、(NH4)2S042g/L和MgS040.6 g/L，此時γ-PGA產(chǎn)量提高了

8、3.2倍。在此配方基礎(chǔ)上進(jìn)行了30 L和200 L的體系放大，發(fā)酵過程中菌體生長、相對粘度、γ-PGA產(chǎn)量和蔗糖利用等過程參數(shù)呈現(xiàn)穩(wěn)態(tài)變化，其中200L體系培養(yǎng)44h時γ-PGA最高產(chǎn)量為4.36 g/L，接近2g/L(NH4)2S04全氨基轉(zhuǎn)移作用可能生成的量(4.46 g/L)，而(NH4)2S04可能成為限制放大發(fā)酵產(chǎn)量的關(guān)鍵因素。另外，采用苯酚硫酸法測定了LL3發(fā)酵生產(chǎn)γ-PGA時含有的多糖副產(chǎn)物成分占到了36%，于是嘗試構(gòu)建打