聚氨基酸的微生物合成及其分子生物學(xué)研究.pdf

1、聚氨基酸具有水溶性、生物可降解性以及生物相容性等，在食品、醫(yī)藥和工業(yè)領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景。
　　本研究對γ-聚谷氨酸合成菌株Bacillus amyloliquefaciens LL3進(jìn)行全基因組測序，對基因組序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析。研究了Bacillus amyloliquefaciens LL3基因組的IS序列、噬菌體相關(guān)序列和跨膜蛋白等，對Bacillus amyloliquefaciensLL3細(xì)胞內(nèi)的L/D谷氨酸代謝通

2、路進(jìn)行分析，對γ-聚谷氨酸相關(guān)的生物合成和代謝調(diào)控基因進(jìn)行了研究。為深入開展γ-聚谷氨酸的分子生物學(xué)研究奠定了基礎(chǔ)。
　　本研究分別從福建古田和遼寧沈陽農(nóng)田土壤中，利用添加亞甲基藍(lán)的甘油合成平板初篩，以Dragendorff試劑復(fù)篩，分離得到兩株ε-聚賴氨酸合成菌株。根據(jù)16S rDNA序列特征，確定均為鏈霉菌屬;根據(jù)伯杰氏手冊第八版中的鏈霉菌屬檢索表，進(jìn)行了培養(yǎng)特征和碳源利用試驗(yàn)。結(jié)果顯示出兩菌株均為小白色鏈霉菌（Strepto

3、myces albulus）。被分別命名為Streptomyces albulus NK660和Streptomyces albulus NK49。
　　本研究利用正交設(shè)計(jì)方法，對Streptomyces albulus NK660發(fā)酵生產(chǎn)ε-聚賴氨酸的培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化。單因素試驗(yàn)結(jié)果表明，最佳碳源和氮源分別是甘油、蛋白胨和硫酸銨。正交試驗(yàn)極差分析顯示，甘油是影響最為顯著的因素，Streptomyces albulus NK660

4、合成ε-聚賴氨酸的培養(yǎng)基的最佳組合為:甘油30g/L，蛋白胨7g/L，硫酸銨4g/L。方差分析顯示，得到的結(jié)果在99％的置信區(qū)間內(nèi)影響顯著。30 L規(guī)模的控制pH條件下補(bǔ)料分批發(fā)酵試驗(yàn)表明，Streptomycesalbulus NK660在培養(yǎng)210h后得到ε-聚賴氨酸產(chǎn)量為4.19 g/L。
　　對發(fā)酵液中產(chǎn)物提取方法進(jìn)行了探索，研究弱酸型離子交換樹脂D152對ε-聚賴氨酸的吸附曲線，最大吸附量以及發(fā)酵液pH對吸附的影響。利用

5、核磁共振，飛行時間質(zhì)譜，傅里葉紅外光譜分析，對兩株ε-聚賴氨酸合成菌株的產(chǎn)物進(jìn)行了鑒定和分析。結(jié)果表明，產(chǎn)物的核磁共振圖譜與標(biāo)準(zhǔn)品一致;飛行時間質(zhì)譜的結(jié)果表明，Streptomyces albulus NK660產(chǎn)物分子量為2453-4248，聚合度為19-33; Streptomyces albulus NK49產(chǎn)物分子量為2710-4376，對應(yīng)聚合度為22-34。由于ε-聚賴氨酸的抗菌機(jī)理與聚合度緊密相關(guān)，所以不同聚合度的ε-聚賴

6、氨酸具有不同抗菌譜，在不同的領(lǐng)域具有應(yīng)用價值。
　　另外，本研究利用分子生物學(xué)手段，對ε-聚賴氨酸合成菌株Streptomycesalbulus NK660的合成酶進(jìn)行了研究。采用染色體步移技術(shù)，在Streptomycesalbulus NK660中克隆到了ε-聚賴氨酸合成酶全基因。利用鏈霉菌中的高拷貝克隆載體pHZ1358，在ε-聚賴氨酸合成酶基因自身啟動子的控制下，首次在Streptomyces lividans ZX7中實(shí)現(xiàn)

7、了ε-聚賴氨酸合成酶基因的異源表達(dá)。異源表達(dá)對于研究ε-聚賴氨酸生物合成的分子機(jī)制和合成菌株培養(yǎng)條件的簡化都具有重要意義。
　　在發(fā)酵過程中溶氧是ε-聚賴氨酸合成的主要限制因素。本研究首次在ε-聚賴氨酸合成菌株中表達(dá)了透明顫菌血紅蛋白VHb，以解決在發(fā)酵過程中的溶氧限制問題。利用位點(diǎn)特異性整合載體pSET152，將透明顫菌血紅蛋白基因vgb整合到Streptomyces albulus NK660染色體的attB位點(diǎn)，構(gòu)建了穩(wěn)定的