利用轉(zhuǎn)座子插入突變篩選高效產(chǎn)油菌株.pdf

1、在能源危機日益嚴重的情況下，利用微生物油脂為原料制備生物柴油在未來生物質(zhì)能源產(chǎn)業(yè)中將發(fā)揮重要作用，因此獲得高產(chǎn)油脂菌株具有重要意義。本文以發(fā)酵性絲孢酵母（Trichosporon rmentans）2．1368為出發(fā)菌株，利用轉(zhuǎn)座子標簽技術將mTn3轉(zhuǎn)座標簽插入到出發(fā)菌株的亮氨酸營養(yǎng)缺陷型中進行隨機突變，從中篩選高產(chǎn)油脂酵母，為進一步研究和分析插入位點基因奠定基礎。 根據(jù)mTn3轉(zhuǎn)座標簽的性質(zhì)，首先利用亞硝基胍誘變篩選出發(fā)酵性絲

2、孢酵2．1368的亮氨酸缺陷型（2．1368-Leu-），這是利用mTn-LacZ/Lzu2轉(zhuǎn)座子標簽文庫質(zhì)粒對出發(fā)菌株進行插入突變的前提；又通過紫外誘變處理2．1368的亮氨酸缺陷型菌株（2．1368-Leu-），篩選尿嘧啶缺陷型，期望獲得雙缺陷型菌株，為后期試驗中用質(zhì)粒拯救法鑒定轉(zhuǎn)座子標簽插入位點奠定基礎。 用mTn3轉(zhuǎn)座標簽插入文庫質(zhì)粒對發(fā)酵性絲孢酵母2．1368進行插入突變，最終得到了166個轉(zhuǎn)化子。試驗中用15個轉(zhuǎn)座子

3、標簽文庫質(zhì)粒進行轉(zhuǎn)化酵母，只有11個質(zhì)粒的酶切產(chǎn)物能夠成功轉(zhuǎn)化。利用LacZ顯色反應，根據(jù)其顯色水平，對同源重組載體進行篩選。結(jié)果發(fā)現(xiàn)11個能夠成功轉(zhuǎn)化的轉(zhuǎn)庵標簽文庫質(zhì)粒中，有9個能夠和出發(fā)菌株進行同源重組，為下一步試驗提供了依據(jù)：同時得到了139株同源重組子，可以從中篩選目的菌株。 利用脂肪酸合成酶抑制劑淺藍菌素（Cerulenin）和磷酸香草醛反應篩選高產(chǎn)油脂酵母菌，并對初篩菌株進行發(fā)酵試驗復篩，最終得到兩株在玉米秸稈糖化液