Mariner轉(zhuǎn)座子體內(nèi)隨機(jī)突變蘇云金芽胞桿菌的研究.pdf

1、蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis）是一種在土壤中廣泛分布的革蘭氏陽性細(xì)菌，在芽胞形成期可以高效表達(dá)殺蟲晶體蛋白并形成晶體。研究者通過各種分子手段探索殺蟲晶體蛋白高效表達(dá)及其形成晶體的機(jī)制并取得了一定的成果，但對這種機(jī)制具體的作用方式，特別是晶體形成的分子機(jī)理，仍然不清楚。本文從mariner轉(zhuǎn)座子在蘇云金芽胞桿菌中的轉(zhuǎn)座效率，插入位點偏愛性的有無以及是否存在插入熱點等方面闡述了mariner轉(zhuǎn)座子在蘇云金芽胞

2、桿菌中的轉(zhuǎn)座特性，為蘇云金芽胞桿菌突變體庫的構(gòu)建和晶體形成機(jī)制的研究提供了有力的工具。
　　 1．測定了mariner整合載體pMarA和pMarB在蘇云金芽胞桿菌無晶體突變株BMB171和蘇云金芽胞桿菌YBT2346中的轉(zhuǎn)座特性。mariner轉(zhuǎn)座子在蘇云金芽胞桿菌無晶體突變株BMB171和野生菌株YBT2346中的轉(zhuǎn)座效率均在10％左右。在BMB171中，插入位點的檢測效率非常低，使得后續(xù)進(jìn)行的插入位點分析難以進(jìn)行。而在YB

3、T2346中，插入位點的檢測也非常低，而且檢測到的都是同一位點。這可能是由于pMarA和pMarB的兩個反向重復(fù)序列之間沒有大腸桿菌的復(fù)制起點，而通過反向PCR或者總DNA酶切產(chǎn)物與線性pUC19連接的方法檢測插入位點的效率同樣非常低。這一缺陷使得插入位點的分析相當(dāng)困難。
　　 2．重新構(gòu)建了mariner整合載體pMarA333和pMarB333。與pMarA和pMarB相比，pMarA333和pMarB333在兩個反向重復(fù)序

4、列之間加入了大腸桿菌的復(fù)制起點，可以用合適的限制性內(nèi)切酶處理總DNA、自連、轉(zhuǎn)化E．coli DH5α便可以檢測插入位點。
　　 3．測定了pMarA333和pMarB333在蘇云金芽胞桿菌無晶體突變株BMB171和蘇云金芽胞桿菌YBT881中的轉(zhuǎn)座特性。pMarA333和pMarB333在蘇云金芽胞桿菌無晶體突變株BMB171中的轉(zhuǎn)座效率分別為7.6％和11.6％。而在蘇云金芽胞桿菌YBT881（CCAM 020673）中的轉(zhuǎn)

5、座效率分別為4.2％和15.7％。pMarA333和pMarB333顯示出比另外一個mariner整合載體pAW068更高的轉(zhuǎn)座效率，這可能是由于轉(zhuǎn)座酶啟動子的不同所導(dǎo)致的。限制性酶切分析發(fā)現(xiàn)，pMarA333和pMarB333在蘇云金芽胞桿菌無晶體突變株BMB171中沒有明顯的插入偏愛性。在蘇云金芽胞桿菌YBT881的插入位點分析中，大部分插入位點的DNA序列都與兩株已經(jīng)完全測序的蘇云金芽胞桿菌97－27（GI：49328240）和A

6、1 Hakam（GI：118415003）進(jìn)行BLAST分析。結(jié)果顯示，mariner轉(zhuǎn)座子的插入位點的分布比較分散，對非編碼區(qū)沒有偏愛性。此外，某些插入位點的序列和已經(jīng)測定的蘇云金芽胞桿菌質(zhì)粒的序列有比較高的相似性，說明mariner轉(zhuǎn)座子可以插入到質(zhì)粒上。因此，mariner 轉(zhuǎn)座子是一個比較良好的轉(zhuǎn)座誘變劑，沒有偏愛性，可以隨機(jī)地插入到染色體和質(zhì)粒上，編碼區(qū)和非編碼區(qū)中。這對研究基因組不同位點的功能是非常有利的。pMarA333和