基于蛋白質組學方法的金納米粒子分子生物相容性機理研究.pdf

1、金納米粒子具有許多優(yōu)良的理化特性，因而在醫(yī)學成像、疾病診斷、藥物載體、腫瘤治療和基因診療等生物醫(yī)學工程領域有著廣泛的應用。由于目前還未形成對納米材料安全性評價的標準體系，納米材料的安全性問題越來越得到各界的重視。為了使納米材料能更安全有效的應用于生物醫(yī)學研究領域，關于它們對細胞以及機體的健康和生物學功能的影響以及作用機理的研究也就顯得越來越重要。目前，關于金納米顆粒分子生物相容性的相關研究還很少。 本論文的研究目的是在金納米顆粒

2、與細胞相互作用的檢測基礎上，采用蛋白質組學技術結合生物信息學分析，從蛋白質水平上對20nm金納米粒子對人皮膚成纖維細胞（HDF-f）的分子生物相容性進行機理研究。通過探索研究納米材料與機體相互作用的機理的新途徑，為建立基于蛋白質組學技術的納米材料分子生物相容性評價的新方法打下基礎。 本論文的具體工作如下： 1、采用檸檬酸鈉還原氯金酸法摸索并制備了20 nm納米金溶膠。采用紫外分光光度計和透射電鏡對制備的納米金溶膠進行表征

3、。此外，對不同水溶劑制備納米金溶膠結果進行了初步探討，并對后續(xù)實驗的納米金溶膠尺寸選擇進行了調研。 2、采用MTT實驗獲得了HDF-f細胞活力代謝標準曲線。通過制備不同濃度的20 nm納米金溶液，首先應用MTT實驗評價了10-300μM納米金處理細胞72 h的細胞毒性，并考察了特定濃度（200μM）的納米金作用細胞1、4、8 h后的細胞毒性；然后采用流式細胞儀技術研究了200μM，20 nm納米金處理細胞1、4、8 h后對細胞周

4、期和后期凋亡的影響。MTT實驗和流式細胞儀的結果顯示，200μM，20 nm納米金對細胞無毒性作用。 3、應用蛋白質組學技術（二維差異凝膠電泳（2D-DIGE）實驗和質譜（Mass spectrometry）實驗）考察了200μM納米金，作用1、4、8h后的細胞發(fā)生差異表達的蛋白情況。采用蛋白免疫印跡實驗（Western blot）對實驗結果中挑選的兩個蛋白進行了初步驗證。通過采用one-way ANOVA差異點篩選原則，獲得了

5、細胞在三個時間點都發(fā)生差異表達蛋白質點40個。應用質譜技術對2D-DIGE獲得的40差異表達蛋白質點進行了鑒定，最終鑒定出36個蛋白點，按照功能蛋白和結構蛋白進行分類，其中有功能蛋白29個，結構蛋白7個。29個功能蛋白分別屬于23種不同蛋白。Western blot結果顯示，兩個蛋白表達情況與2D-DIGE結果一致。 4、應用Cluster和TreeView軟件對200μM，20nm納米金作用HDF-f1、4、8 h后三個實驗組

6、發(fā)生的40個差異表達蛋白進行層次聚類分析，對蛋白表達模式隨時間變化的規(guī)律進行分類和研究。所有差異表達蛋白在三個時間點都上調表達的有9個；都下調表達的13個；既有上調又有下調表達的18個。所有差異表達蛋白的可分為8種表達模式。研究發(fā)現(xiàn)質譜鑒定出的相同或功能相似蛋白，大部分都聚類在同一表達模式中。 5、應用GoSurfer。軟件對200μM，20 nm納米金作用HDF-f1、4、8 h后三個實驗組發(fā)生差異表達的23種功能蛋白進行GO

7、功能分類分析，對差異表達的蛋白按照生物學過程（Biologicalprocess）、分子功能（Molecular function）、細胞組分（Cellular component）結構層級進行功能分類研究。根據(jù)對所有差異表達的功能蛋白進行生物學過程分類研究，發(fā)現(xiàn)，差異表達蛋白富集的生物學過程主要涉及細胞過程和生理過程；分子功能主要涉及結合和催化活性；細胞組分主要涉及細胞和細胞器。通過GO分析，發(fā)現(xiàn)差異表達蛋白涉及的生物學功能廣泛，這提

8、示納米金可能對細胞有廣泛作用。 6、應用GenMAPP生物學途徑分析軟件和Ingenuity Pathway Analysis（IPA）分析平臺對200μM，20 nm納米金作用HDF-f1、4、8 h后三個實驗組發(fā)生差異表達的23種功能蛋白參與的生物學途徑和蛋白相互作用網(wǎng)絡進行分析。GenMAPP分析結果顯示：23種差異蛋白共涉及21個MAPPs；對其中17個“HS Contributed MAPPs”涉及的生物學途徑進行了詳