WIG-1在食管癌組織及人源性食管鱗癌細胞系EC109中的表達及其臨床意義研究.pdf

1、背景
　　食管癌是常見的惡性腫瘤之一,近些年來發(fā)病率有所上升,與其他惡性腫瘤相比其預后較差,糾其主要原因就是門部分食管癌在早期就己經(jīng)發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移和淋巴轉(zhuǎn)移。近年來,基因治療成為腫瘤治療方面的一大熱點,有可能成為未來治療腫瘤的一個有效手段,對于食管癌來說,基因?qū)哟蔚难芯枯^其他腫瘤來說還比較少,因此尋找一個在食管癌發(fā)生、移轉(zhuǎn)中能夠起到關鍵作用的分子就顯得比較迫切[1]。WIG-1(wild-type p53-induced gene1

2、,野生型p53誘導基因1)是一種由p53基因誘導表達的鋅指蛋白,與雙鏈 RNA結(jié)合后,能夠發(fā)揮抑制細胞生長的作用,因此有可能是食管癌的一個潛在的基因治療靶點。本研究通過分析WIG-1在不同食管癌組織的表水平達差異,得到其與食管癌患者的預后可能存在的關系;并通過構(gòu)建WIG-1不同表達水平的人源性食管鱗癌細胞系EC109,來進一步探討WIG-1對食管鱗癌細胞主要的生物學行為方面的影響以及可能的作用機制,并進一步篩選出WIG-1可能的作用分子

3、,可望為食管癌的基因治療方面提供一定的臨床應用價值。
　　目的
　　制備WIG-1單克隆抗體,為進一步的研究工作打下堅實的基礎。了解WIG-1不同的表達水平與食管癌患者臨床表現(xiàn)之間的關系;構(gòu)建WIG-1高表達與低表達的人源性食管鱗癌細胞系EC109,從而可以進一步研究WIG-1基因?qū)τ贓C109細胞的生長、凋亡以及侵襲等生物學行為的影響;探討 WIG-1對 EC109細胞的化療藥物敏感性、化療藥物的耐藥性以及對細胞損傷、修復

4、等能力的影響,并提出其可能的分子機制;通過WIG-1對基因表達譜的影響來篩選出其可能的作用分子。
　　方法
　　應用雜交瘤技術制WIG-1單克隆抗體;
　　應用RT-PCR和免疫組化技術檢測食管癌組織及其對應近癌、遠癌組織中WIG-1基因的表達;
　　應用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法構(gòu)建了 WIG-1基因高表達與低表達的人源性食管鱗癌細胞系EC109,并用RT-PCR和Western blot技術進行鑒定;
　　應用MTT

5、實驗繪制WIG-1基因不同表達水平的EC109細胞的生長曲線;
　　應用MTT實驗、平板克隆實驗、流式細胞儀技術以及DNA斷裂實驗檢測WIG-1基因不同表達水平的EC109細胞的細胞周期和細胞凋亡的變化;
　　應用Transwell侵襲小室實驗和細胞損傷刮擦試驗來檢測WIG-1基因不同表達水平對人源性食管鱗癌細胞系EC109侵襲活性的影響;
　　應用MTT實驗進行體外藥物敏感性分析,計算細胞對藥物的IC50值;

6、　　應用Western Blot檢測WIG-1基因的不同表達水平對部分耐藥分子表達水平的影響;
　　應用單細胞凝膠電泳技術檢測 WIG-1基因不同表達水平對于由紫外線照射造成的不同的DNA損傷情況及修復能力;
　　10、應用基因芯片技術檢測WIG-1基因?qū)C109細胞基因表達譜的影響;
　　11、就用酵母雙雜交技術篩選出WIG-1基因可能的作用分子。
　　結(jié)果
　　1、成功制備了WIG-1單克隆抗體,并通

7、過Western Blot及免疫組化實驗證實;
　　2、WIG-1基因在食管癌腫瘤的不同部位的標本中存在差異性表達,食管癌組織中WIG-1基因的表達水平明顯低于近癌及遠癌組織,而近癌組織則顯著低于遠癌組織(p<0.05);
　　成功構(gòu)建了WIG-1基因高表達及低表達的人源性食管鱗癌細胞株EC109,并通過半定量RT-PCR及Western blot實驗證實;
　　MTT法、平板克隆形成實驗、DNA斷裂實驗、流式細胞儀技

8、術、Transwell侵襲小室實驗以及細胞損傷刮擦實驗等的結(jié)果表示,WIG-1基因的高表達可以抑制EC109細胞的增殖,促進其凋亡,并能夠顯著降低人源性食管鱗癌細胞系EC109的侵襲、移動能力;
　　5、WIG-1基因的高表達能夠顯著增強EC109細胞對5-氟尿嘧啶(5-Fu)、順鉑(CDDP)、阿霉素(ADR)等化療藥物的敏感性,對長春新堿(VCR)的敏感性,則無明顯影響,WIG-1基因可能通過抑制ERCC1及P-gp的表達進而

9、提高EC109細胞對于化療藥物的敏感性,降低EC109細胞對化療藥物的耐受性;
　　6、WIG-1基因的高表達能夠減少紫外線照射對EC109細胞的DNA損傷效應,并顯著增強EC109細胞的DNA修復能力;
　　7、基因芯片檢測結(jié)果表明,上調(diào)WIG-1基因的表達水平可以影響419種基因的表達,而上調(diào)WIG-1基因的表達水平可能影響301種基因的表達;
　　8、酵母雙雜交實驗結(jié)果篩選出WIG-1基因的可能作用分子為:ILF

10、3(NM_017620), UTP14A(NM_006649),Sox3(NM_005634)。
　　結(jié)論
　　制備了WIG-1單克隆抗體,為本實驗研究以及進一步的深入研究奠定了一個良好的基礎。并構(gòu)建了WIG-1基因高表達及低表達的人源性食管鱗癌細胞株EC109。WIG-1基因不僅在食管癌組織細胞中有表達,且在正常的組織細胞中亦有表達,其食管癌組織中的表達水平顯著低于對應近癌及遠癌組織;WIG-1基因的高表達可以抑制EC10

11、9細胞的增殖,促進其凋亡,而 WIG-1基因的低表達可以促進 EC109細胞增殖,抑制其凋亡;WIG-1表達水平增高可以抑制ERCC1和P-gp的表達,進而提高EC109細胞對于化療藥物的敏感性,而WIG-1表達水平下降時,結(jié)果恰恰恰相反;WIG-1基因高表達可以增強EC109細胞的紫外線耐受性及DNA修復能力;上調(diào)或下調(diào)WIG-1基因表達水平可以影響多種基因的表達,希望在進一步的研究中可以探尋到 WIG-1基因,作為一個己知抑癌基因的