細(xì)胞色素P450 2D6穩(wěn)定表達(dá)的細(xì)胞系的構(gòu)建及其基因多態(tài)性對阿立哌唑體外代謝的影響.pdf

1、目的：本課題進(jìn)行細(xì)胞色素P4502D6穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系的構(gòu)建并研究CYP2D6不同基因型對阿立哌唑代謝的影響，通過比較不同CYP2D6基因型對阿立哌唑的代謝情況，證明CYP2D6不同基因型是否會影響阿立哌唑代謝的體外過程，為基因?qū)蛐詡€體化用藥提供實驗依據(jù)。
　　 方法：提取人肝臟組織中mRNA，并逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，PCR擴(kuò)增目的基因CYP2D6*1(野生型)序列，再以此為模板，通過定點(diǎn)突變PCR，體外構(gòu)建*10(突變型)cDN

2、A。將CYP2D6*1cDNA和*10cDNA連接到pcDNA3.1載體上并在HepG2細(xì)胞中高表達(dá)，提取重組酶蛋白，用蛋白質(zhì)印跡法驗證其表達(dá)，采用探針?biāo)幬锒∵宦鍫枌YP2D6*1及*10進(jìn)行酶動力學(xué)分析，驗證代謝酶活性，同時采用抑制劑奎尼丁進(jìn)行酶抑制實驗，驗證模型的正確性。底物阿立哌唑與表達(dá)細(xì)胞系共孵育后，吸取上清液，采用HPLC技術(shù)測得各底物濃度，算出各酶代謝底物阿立哌唑的米氏常數(shù)(Km)和最大酶促反應(yīng)速率(Vmax)，并算出內(nèi)在

3、清除率(CLint)。
　　 結(jié)果：實時定量PCR顯示目的基因CYP2D6擴(kuò)增良好，篩選的細(xì)胞系中都有CYP2D6的表達(dá)，Western-blowing印跡顯示CYP2D6*1和*10都得到很好的表達(dá)。在對丁呋洛爾的代謝中，CYP2D6*1的Km值為18.93±1.094，CYP2D6*10的Km值為14.21±2.576，可得出CYP2D6*1和CYP2D6*10對丁呋洛爾的親和力無明顯差異；CYP2D6*1的Vmax值為16

4、0.8±3.518，CYP2D6*10的Vmax值為26.11±1.642，可得出CYP2D6*10對丁呋洛爾的最大反應(yīng)速率約為CYP2D6*1的1/6；CYP2D6*1的CLint值為8.494±1.143，CYP2D6*10的CLint值為1.837±0.279，可得出CYP2D6*10對丁呋洛爾的內(nèi)在清除率約為CYP2D6*1的1/5。在對阿立哌唑的代謝中，CYP2D6*1的Km值為24.23±3.027，CYP2D6*10的Km

5、值為10.28±1.301，可得出CYP2D6*10對阿立哌唑的親和力比CYP2D6*1要高；CYP2D6*1的Vmax值為42.18±2.156，CYP2D6*10的Vmax值為7.844±0.313，可得出CYP2D6*10對阿立哌唑的最大反應(yīng)速率約為CYP2D6*1的1/6；CYP2D6*1的CLint值為1.741±0.196，CYP2D6*，10的CLint值為0.763±0.087，可得出CYP2D6*10對阿立哌唑的內(nèi)在清