利用核糖體工程技術(shù)開拓海洋微生物藥用新資源的研究.pdf

1、在微生物的篩選過程中，95％的菌株在現(xiàn)有篩選模型下不顯示任何生物活性的菌株。如何有效合理利用這些菌株，是眾多學(xué)者關(guān)注的問題。本文利用核糖體工程技術(shù)對(duì)這些菌株二次開發(fā)，對(duì)開拓海洋微生物藥用新資源的方法學(xué)進(jìn)行了探討。 本實(shí)驗(yàn)以一株沒有抗腫瘤活性的海洋放線菌玫瑰黃鏈霉菌為出發(fā)菌株，采用引入抗生素(氯霉素，鏈霉素)抗性的方法，即核糖體工程技術(shù)，進(jìn)行誘導(dǎo)突變，共獲得有抗生素抗性的突變株270株。突變株的菌落形態(tài)、孢子顏色以及代謝產(chǎn)物與母體

2、菌株有顯著的差異。對(duì)突變株的發(fā)酵產(chǎn)物利用小鼠乳腺癌細(xì)胞tsFT210，以細(xì)胞周期抑制、細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)及壞死性細(xì)胞毒活性為指標(biāo)，進(jìn)行活性篩選，共獲得有顯著抗腫瘤活性的突變株3株。 對(duì)其中一株活性較好的突變株Str3054進(jìn)行大量發(fā)酵，采用活性追蹤的方法對(duì)其發(fā)酵產(chǎn)物的活性成分進(jìn)行初步分離，共獲得6個(gè)單體化合物；利用波譜學(xué)方法闡明了其中5個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)，分別為：鄰苯二甲酸二異丁酯，丁烯二酸二-2-乙基正己酯(Z，R，R)，次黃嘌呤核苷，

3、尿嘧啶核苷，環(huán)(Pro-Gly)二肽；其中丁烯二酸二-2-乙基正己酯(Z，R，R)為新化合物。利用tsFT210細(xì)胞鏡檢，流式細(xì)胞術(shù)和SRB法對(duì)化合物進(jìn)行活性評(píng)價(jià)，其中4個(gè)化合物表現(xiàn)出一定的壞死性細(xì)胞毒活性，1個(gè)化合物表現(xiàn)為細(xì)胞周期抑制活性。 對(duì)該菌株突變前后的核糖體S12蛋白編碼的基因rpsL進(jìn)行PCR擴(kuò)增表達(dá)，將表達(dá)產(chǎn)物轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5a，進(jìn)行測序。比較菌株突變前后的rpsL序列差別，發(fā)現(xiàn)該段基因并沒有發(fā)生點(diǎn)突變，推測可能

4、存在其它突變位點(diǎn)影響該菌株的鏈霉素抗性，尋找新突變點(diǎn)的研究有待于進(jìn)一步深入。該測序結(jié)果通過GenBank的查找，與StreptomycesfilamentosusS12蛋白對(duì)應(yīng)的rpsL基因有97％的相似度，證明本實(shí)驗(yàn)克隆得到的序列正是rpsL基因。 綜上，本文利用核糖體工程技術(shù)首次對(duì)沒有抗腫瘤活性的海洋放線菌進(jìn)行誘變，得到具有顯著抗腫瘤活性的突變株。對(duì)該突變株的代謝產(chǎn)物進(jìn)行初步研究，得到具有抗腫瘤活性的單體化合物，實(shí)驗(yàn)結(jié)果證實(shí)