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文檔簡介
1、中風(fēng)是人類致殘、致死的主要原因之一;腦梗塞是腦血管病中最常見的類型.近年來人們對缺血再灌注腦損傷的機(jī)制有了全新的認(rèn)識.Ca<'2+>超載在缺血中心區(qū)腦組織的損傷中起重要作用,而細(xì)胞凋亡是缺血周邊區(qū)遲發(fā)性神經(jīng)元損傷的主要原因.最近的研究表明,凋亡也參與缺血中心區(qū)的損傷,而Ca<'2+>超載也參與凋亡的發(fā)生.抑制凋亡的發(fā)生,或者阻止細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>超載,均可以減輕腦組織缺血再灌注損傷.Calbindin D28K(CaBP)是細(xì)胞內(nèi)天然
2、存在的Ca<'2+>緩沖劑,維持細(xì)胞內(nèi)Ca<'2+>穩(wěn)態(tài),使細(xì)胞免受由于Ca<'2+>增高所致的損傷;而XIAP被認(rèn)為是目前作用最強(qiáng)的凋亡抑制因子,可以同時(shí)抑制Caspase-3,7,9,從而抑制凋亡的發(fā)生.已有資料表明,二者對缺血再灌注腦損傷有保護(hù)作用.血腦屏障和生物膜的存在,不允許大分子多肽或蛋白進(jìn)入細(xì)胞,而通過病毒等載體進(jìn)行轉(zhuǎn)基因操作則因?yàn)榇嬖谠S多問題,限制了其實(shí)際應(yīng)用.PTD介導(dǎo)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)技術(shù)既可以高效地將目的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入靶
3、器官細(xì)胞中,又可以透過血腦屏障進(jìn)入腦組織神經(jīng)元,為解決這一問題提出新思路.基于以上情況,該實(shí)驗(yàn)選擇阻滯Ca<'2+>超載和抑制細(xì)胞凋亡這兩個(gè)作用靶點(diǎn),首先用原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)并純化融合蛋白PTD-CaBP及PTD-XIAP(BIR3-RING),然后通過PTD介導(dǎo)的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用,分別在體外和體內(nèi)研究它們的缺血性腦保護(hù)作用,為探索缺血腦保護(hù)的新途徑提供理論基礎(chǔ).結(jié)論1用重組pTrans Vector質(zhì)粒表達(dá)的融合蛋白PTD-XIAP(BI
4、R3-RING)和PTD-Calbindin D28K不僅可以高效地轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)入體外培養(yǎng)的cos7細(xì)胞及器官型海馬腦片細(xì)胞內(nèi),而且通過腹腔注射入小鼠體內(nèi)后可以被吸收入血,穿透血腦屏障而進(jìn)入腦細(xì)胞內(nèi);2細(xì)胞凋亡在大鼠腦缺血再灌注損傷中起重要作用.缺血2h、再灌注72h后,缺血周邊區(qū)可見大量的活性Caspase-3(+)及TUNEL(+)細(xì)胞;在梗死中心區(qū)殘存的細(xì)胞內(nèi)也可發(fā)現(xiàn)這些陽性細(xì)胞.梗死側(cè)半球內(nèi)出現(xiàn)大量的活性Caspase-3片斷,Pro
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