含功能基肽核酸單體的合成.pdf

1、1991年，哥本哈根大學(xué)的Riso實(shí)驗(yàn)室的Nielsen等人以酰胺鍵連接的N-(2-氨乙基)甘氨酸骨架單位代替了核酸中磷酸二酯鍵連接的核糖-磷酸骨架單位，設(shè)計(jì)合成了肽核酸(簡稱PNA)。 在PNA分子中，天然核酸堿基通過亞甲基羰基連在骨架甘氨酸的氮原子上，形成了類似多肽骨架的核酸分子。PNA的空間結(jié)構(gòu)是DNA和RNA非常好的模擬物，保留了與互補(bǔ)DNA或RNA及PNA之間以堿基配對原則結(jié)合的能力，而且這種結(jié)合遵從Waston-Cr

2、ick氫鍵結(jié)合的原則。PNA/DNA和PNA/RNA的復(fù)合物要比相應(yīng)的DNA/DNA和RNA/RNA穩(wěn)定得多。由同聚嘧啶PNA和同聚嘌呤DNA形成的(PNA)2/DNA則具有更高的穩(wěn)定性。而且，PNA與DNA和RNA之間的雜交熱穩(wěn)定性有以下特點(diǎn)：(1)PNA-DNA雜交不受離子強(qiáng)度的影響；(2)PNA-PNA>PNA-RNA>PNA-DNA>DNA-DNA。而聚酰胺的骨架特點(diǎn)使PNA可以采用經(jīng)典的Fmoc/tBu或Boc/Bzl固相多肽

3、合成策略制備，操作簡單、費(fèi)用低、效率高，并可適當(dāng)放大量制備。與DNA或RNA相比，PNA具有更好的化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性，不易被核酸酶和蛋白酶降解；PNA結(jié)構(gòu)中無電負(fù)性磷酸二酯鍵的連接橋而呈電中性，避免了與血漿相互作用，從而降低了其非特異性作用發(fā)生的可能。 但是，由于PNA自身電中性骨架的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，使其在水溶性和生物學(xué)利用度等方面表現(xiàn)較差，并且具有自聚傾向，這些缺點(diǎn)是目前其在應(yīng)用領(lǐng)域的主要障礙。 迄今已有多種對PNA骨架和堿

4、基的修飾，其主要目的是改善經(jīng)典PNA的水溶性，增強(qiáng)雜交親和力和序列選擇性，提高生物利用度，拓展PNA在分子生物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用。對PNA單體的結(jié)構(gòu)改造與修飾主要分為以下幾個部分：(1)骨架的修飾；(2)堿基的修飾；(3)骨架和堿基同時修飾。 骨架的修飾：對PNA單體的骨架修飾的方式是多種多樣的，概括起來主要有以下幾種：(1)單體兩端化學(xué)活性位點(diǎn)(N端和C端)修飾；(2)改變單體從N端到C端之間的鍵數(shù)，即改變骨架長度；(3)用手性氨基

5、酸代替甘氨酸在α位引進(jìn)修飾基團(tuán)；(4)用手性氨基酸在γ位引進(jìn)修飾基團(tuán)；(5)在單體N端和C端之間引入環(huán)狀結(jié)構(gòu)。 堿基的修飾：主要是在堿基上的某些位點(diǎn)進(jìn)行修飾或者用其它含氮基團(tuán)代替核酸堿基。因?yàn)樗脑斓腜NA序列將用于形成高級結(jié)構(gòu)，因此對單體的改造必須不影響堿基間氫鍵的形成。(1)脲嘧啶的5位引入官能團(tuán)，因?yàn)檫@個位點(diǎn)不參與氫鍵的形成，不會引入大的立體化學(xué)障礙。(2)引入偽胞嘧啶，2，6-二氨基嘌呤等天然堿基的類似物。(3)胸腺嘧啶

6、和胞嘧啶雜環(huán)化修飾。(4)引入能夠進(jìn)行熒光標(biāo)記的堿基。骨架和堿基同時修飾：目前，大多是在骨架或堿基上分別對PNA單體進(jìn)行修飾，同時進(jìn)行修飾的單體尚未見報道。堿基和骨架同時進(jìn)行修飾，要充分考慮保護(hù)基的正交性原則，以利于肽核酸的序列合成。除了考慮氨基的保護(hù)外，還要考慮氨基酸側(cè)鏈的保護(hù)；在堿基上引入保護(hù)基時，也要充分考慮到與骨架上氨基保護(hù)基和氨基酸側(cè)鏈保護(hù)基之間的正交保護(hù)問題。 2002年，ISIS公司購買了PNA的相關(guān)專利，準(zhǔn)備將其

7、發(fā)展為第三代反義寡聚核苷酸，這標(biāo)志著PNA成為藥物的前景已逐漸被看好。肽核酸能與DNA和RNA特異性結(jié)合及化學(xué)和生物學(xué)穩(wěn)定性等特性使其在分子生物學(xué)領(lǐng)域得到了廣泛的應(yīng)用，也帶動與之相關(guān)的化學(xué)、分子生物學(xué)和生物技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展。 目的：由于經(jīng)典肽核酸自身功能基較少，缺乏參與生物和化學(xué)活性的官能團(tuán)，結(jié)合課題組進(jìn)行的利用PNA高級結(jié)構(gòu)，進(jìn)行結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的探索研究的需要，本課題從堿基和骨架兩方面引入功能基。 (1)利用尿嘧啶的5位

8、引入羧甲基官能團(tuán)； (2)將骨架中的甘氨酸以絲氨酸或天冬氨酸代替，在骨架中引入羧基和羥基。 方法：在PNA序列的固相合成中采用了Boc/Bzl保護(hù)策略，要求單體的羧基部分游離，氨基采用叔丁氧羰基加以保護(hù)。為滿足固相合成的需要以及單體合成過程中保護(hù)基的穩(wěn)定，在骨架和堿基的合成中采用了相應(yīng)的保護(hù)基團(tuán)。對于骨架，以臨時性保護(hù)基叔丁氧羰基和烯丙基分別保護(hù)骨架兩端的氨基和羧基，以半永久性基團(tuán)芐基保護(hù)骨架中氨基酸側(cè)鏈基團(tuán)；對于堿基部

9、分，采用半永久性保護(hù)基苯甲酰基和芐基，分別保護(hù)腺嘌呤的環(huán)外氨基和5-羧甲基尿嘧啶的羧基；這些半永久性保護(hù)基確保了這些引入功能基在單體的合成和序列合成過程中的穩(wěn)定性。最后這些半永久性保護(hù)基經(jīng)氟化氫裂解全部脫除。 結(jié)果：結(jié)合文獻(xiàn)，按照設(shè)計(jì)的路線完成了反應(yīng)。 (1)N-(2-叔丁氧羰基氨基乙基)-N-[5-(芐氧羰基乙基)尿嘧啶-1-乙?；鵠-O-芐基-L-絲氨酸。 (2)N-(2-叔丁氧羰基氨基乙基)-N-[5-(芐

10、氧羰基乙基)尿嘧啶-1-乙?；鵠-β-O-芐酯-L-天冬氨酸。 結(jié)論： 1.在合成過程中，采用了合適的正交保護(hù)策略。 2.中間體(3)合成中，通過降低反應(yīng)溫度和苯甲酰氯的滴加速度，減少副產(chǎn)物。 3.由于中間體(7)溶解性較差，采用一般的酯化方法收率較低。而采用縮合劑酯化的方法收率較高。 4.中間體(8)與溴乙酸叔丁酯反應(yīng)時，1位和3位氮上的氫都會被取代，降低反應(yīng)溫度可以減少3位氮上氫被取代的情況。