以細(xì)菌RNA聚合酶σ70為靶點(diǎn)的反義肽核酸的設(shè)計(jì)、合成及其抗菌作用研究.pdf

1、目的：
　　細(xì)菌耐藥已經(jīng)成為威脅人類健康的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題，尤其是對(duì)多種抗生素耐藥的“超級(jí)細(xì)菌”的出現(xiàn)，及其在全世界范圍內(nèi)的播散，使耐藥細(xì)菌感染成為臨床抗感染治療中極為棘手的問題。由于這些“超級(jí)細(xì)菌”對(duì)多種抗生素耐藥，可供治療選擇的抗生素十分有限，而且臨床上尚無特異性治療藥物，感染后患者死亡率很高，因此，“超級(jí)細(xì)菌”感染被列為世界上最難治療感染性疾患。面對(duì)“超級(jí)細(xì)菌”種類日趨增多和迅速蔓延，以及感染后致死率繼續(xù)攀高的嚴(yán)峻形勢(shì)，如何

2、有效控制“超級(jí)細(xì)菌”感染造成的危害已經(jīng)成為各國(guó)政府高度關(guān)注的焦點(diǎn)，尋找和研制有效控制“超級(jí)細(xì)菌”感染的新策略和新藥物，已成為當(dāng)今世界各國(guó)科學(xué)家當(dāng)務(wù)之急的研究目標(biāo)。
　　經(jīng)典的抗生素研發(fā)重要策略之一是從已有各種類別抗生素中研發(fā)新的衍生物。伴隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，越來越多的細(xì)菌對(duì)現(xiàn)有抗生素產(chǎn)生交叉耐藥，采用結(jié)構(gòu)修飾和改造研發(fā)新型抗生素受到限制，抗生素研發(fā)速度明顯減慢。而且新型抗生素應(yīng)用于臨床后，并不能從根本上避免細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性，細(xì)菌很

3、快會(huì)對(duì)這些抗生素產(chǎn)生新的耐藥性。而且抗生素耐藥菌株的出現(xiàn)速度已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了研發(fā)新抗生素的速度，特別是多藥耐藥的“超級(jí)細(xì)菌”成為未來細(xì)菌耐藥新趨勢(shì)。
　　為了有效對(duì)抗日益嚴(yán)重的超級(jí)耐藥細(xì)菌，必須尋找新的突破口。反義抗菌劑突破以細(xì)菌蛋白為靶點(diǎn)的經(jīng)典研究思路，根據(jù)細(xì)菌體內(nèi)基因組學(xué)相關(guān)信息，以細(xì)菌體內(nèi)增值、致病性、耐藥相關(guān)基因?yàn)榘悬c(diǎn)，從阻斷相關(guān)基因的表達(dá)入手，進(jìn)而達(dá)到抑制或殺滅細(xì)菌的作用，因而被認(rèn)為是被對(duì)抗耐藥細(xì)菌的新策略和突破口。盡管已

4、有的研究已經(jīng)證實(shí)反義抗菌劑在抑制細(xì)菌靶基因方面顯示出可靠的靶基因抑制效果，良好的抗菌作用。但是仍有2個(gè)主要問題制約其向應(yīng)用的研發(fā)，其一，靶基因抑制過分專一，目前幾乎所有反義抗菌的研究主要集中在針對(duì)單一菌株的單一基因，因此僅對(duì)特定菌株產(chǎn)生作用，無法實(shí)現(xiàn)廣譜抗菌作用，進(jìn)而限制其臨床應(yīng)用的潛在可能；其二，細(xì)胞攝入率低，反義分子的分子量較大，裸分子攝取進(jìn)入細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)的量極低。
　　針對(duì)上述問題，本課題確定以下2個(gè)研究目標(biāo)：?尋找具有作為廣

5、譜反義抗菌劑潛在靶點(diǎn)的靶基因，并確定其有效性；?研究促進(jìn)反義分子進(jìn)入細(xì)菌的遞藥策略?；谏鲜瞿繕?biāo)，我們以當(dāng)前臨床感染中最常見、耐藥發(fā)生率和耐藥強(qiáng)度最高的六種革蘭氏陰性致病菌,包括大腸埃希氏桿菌（Escherichiacoli,E.coli），腸炎沙門氏菌（Salmonellaenterica,SE）、肺炎克雷伯桿菌銅（Klebsiellapneumoniae,KP）、弗氏志賀菌（Shigellaflexneri,SF）、鮑曼氏不動(dòng)桿菌（

6、Acinetobacterbaumanni,AB）及銅綠假單孢菌（Pseudomonasaeruginosa,PA）為研究對(duì)象，以上述細(xì)菌體內(nèi)共有的編碼RNA聚合酶?70因子的基因rpoD為靶點(diǎn)，設(shè)計(jì)并合成抗rpoD的肽核酸，將其與透膜肽（CPP）共價(jià)連接制備成反義抗rpoD因子肽核酸（anti-rpoDpPNA），在體外觀察其抗菌譜、抗菌活性、穩(wěn)定性，及其是否誘導(dǎo)細(xì)菌耐藥等效應(yīng)，在體內(nèi)觀察anti-rpoDpPNA對(duì)感染動(dòng)物的保護(hù)效應(yīng)

7、。同時(shí)，與最先報(bào)道攜帶NDM-1耐藥基因超級(jí)細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)室合作，證實(shí)anti-rpoDpPNA抗超級(jí)細(xì)菌的有效性。
　　方法：
　　1.anti-rpoDpPNA的設(shè)計(jì)與合成
　　根據(jù)大腸埃希菌（E.coli），腸炎沙門氏菌（SE）、肺炎克雷伯桿菌銅（KP）、弗氏志賀菌（SF）、鮑曼氏不動(dòng)桿菌（AB）和銅綠假單孢菌（PA）六種革蘭氏陰性細(xì)菌編碼RNA聚合酶σ70因子基因rpoD的序列，采用BLAST軟件比對(duì)其序列確定同源

8、區(qū)域，并依據(jù)RNAstructure4.6軟件預(yù)測(cè)rpoDRNA二級(jí)結(jié)構(gòu)，確定反義結(jié)合可能靶序列，綜合多項(xiàng)參數(shù)（主要為結(jié)合能量參數(shù)、PNA解鏈溫度和靶RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)）優(yōu)化設(shè)計(jì)抗rpoD的反義肽核酸（PNA），采用Fmoc方法在固相載體上自動(dòng)合成抗rpoD反義PNA（anti-rpoDpPNA）以及作為對(duì)照的裸PNA、裸透膜肽（CPP）和錯(cuò)配PNA-CPP結(jié)合物（mismatchedanti-rpoDpPNA），采用RP-HPLC對(duì)樣品進(jìn)

9、行分離純化，MALDI-TOF測(cè)定純化后樣品的分子量。
　　2.anti-rpoDpPNA反義靶位有效性的體外篩選及最優(yōu)anti-rpoDpPNA的體外藥效學(xué)評(píng)價(jià)與穩(wěn)定性研究
　　選擇上述六種致病細(xì)菌的敏感菌株和多藥耐藥菌株為研究對(duì)象，以最低抑菌濃度（MIC）、細(xì)菌生長(zhǎng)曲線、菌落形成單位（CFU）計(jì)數(shù)作為評(píng)價(jià)指標(biāo)，對(duì)制備的系列anti-rpoDpPNA的抗菌活性和抗菌譜進(jìn)行評(píng)價(jià)，篩選出具有最優(yōu)抗菌活性和最廣抗菌譜的anti-

10、rpoDpPNA，確定rpoD最敏感的反義抑制靶序列位置。
　　首次在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》和《柳葉刀-傳染病》對(duì)超級(jí)細(xì)菌耐藥基因NDM-1進(jìn)行報(bào)道的Nordmann教授和Livemore教授的研究團(tuán)隊(duì)，選取攜帶NDM-1基因的人類致病革蘭氏陰性細(xì)菌，主要包括大腸桿菌、肺炎克雷伯桿菌、鮑曼氏不動(dòng)桿菌、陰溝腸桿菌（Enterobacterdoacae）和弗氏檸檬酸桿菌（Citrobacterfreundii），測(cè)定我們篩選到的最優(yōu)an

11、ti-rpoDpPNA各菌的MIC和MBC。
　　我們采用RT-PCR和WesternBlot方法，檢測(cè)最優(yōu)anti-rpoDpPNA對(duì)上述六種致病細(xì)菌rpoDmRNA和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響，確證其反義抗菌作用的靶位特異性。進(jìn)一步采用RT-PCR方法檢測(cè)最優(yōu)anti-rpoDpPNA對(duì)受大腸埃希菌rpoD調(diào)控的下游多個(gè)重要致病基因，包括seqA、ftsZ、mazF、prfB、rpoS、tufB和ygjD表達(dá)的影響，揭示最優(yōu)anti

12、-rpoDpPNA抗菌作用機(jī)制。
　　將最優(yōu)anti-rpoDpPNA與大鼠血漿共孵育，電泳法觀察anti-rpoDpPNA在大鼠血漿中的穩(wěn)定性；采用測(cè)定藥物對(duì)連續(xù)多代培養(yǎng)細(xì)菌MIC變化的方法，評(píng)估anti-rpoDpPNA誘導(dǎo)ESBLs-EC產(chǎn)生耐藥性的情況；建立人胃粘膜上皮細(xì)胞與單一（E.coliMG1655）或多種細(xì)菌（EC、SE和PA）共培養(yǎng)的感染模型，分別觀察不同濃度最優(yōu)anti-rpoDpPNA的廣譜殺菌作用及其對(duì)細(xì)胞

13、的保護(hù)作用。
　　3.最優(yōu)anti-rpoDpPNA體內(nèi)抗菌藥效學(xué)體內(nèi)抗菌藥效學(xué)研究
　　建立BALB/c小鼠的ESBLs-EC和MDR-SF膿毒血癥模型，觀察不同濃度anti-rpoDpPNA對(duì)BALB/c感染小鼠生存時(shí)間、存活率的影響；取感染小鼠的肝、脾、肺、腎，勻漿后將稀釋菌液涂布于MH瓊脂培養(yǎng)基，觀察臟器中細(xì)菌菌落計(jì)數(shù)，以及最優(yōu)anti-rpoDpPNA對(duì)上述臟器內(nèi)ESBLs-EC和MDR-SF生長(zhǎng)影響；取感染小鼠肝

14、、脾、肺、腎組織，HE染色，觀察最優(yōu)anti-rpoDPNA-CPP對(duì)感染組織形態(tài)學(xué)的影響。
　　結(jié)果：
　　1.anti-rpoDpPNA的優(yōu)化設(shè)計(jì)、合成與靶位篩選
　　應(yīng)用BLAST軟件對(duì)大腸埃希菌、腸炎沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌、弗氏志賀菌、鮑曼氏不動(dòng)桿菌和銅綠假單孢菌等六種革蘭氏陰性細(xì)菌編碼RNA聚合酶σ70因子的基因rpoD的序列進(jìn)行同源性分析，結(jié)果顯示，上述細(xì)菌rpoD1.1區(qū)域的序列共享堿基序列最多，其中大

15、腸埃希菌、腸炎沙門氏菌、肺炎克雷伯桿菌和弗氏志賀菌此區(qū)域序列相似性高達(dá)98％，可以作為廣譜反義PNA的靶基因部位。
　　RNAstructure軟件對(duì)rpoDmRNA1.1區(qū)域分析的結(jié)果顯示，該區(qū)域無明顯的穩(wěn)定雙鏈結(jié)構(gòu)，同時(shí)，采用12個(gè)堿基（最優(yōu)長(zhǎng)度/效價(jià)比）為PNA設(shè)計(jì)的基本長(zhǎng)度，結(jié)合Oligowalk和PNA的Tm軟件預(yù)測(cè)的參數(shù)，選取該區(qū)域的1-11、2-13、3-14、11-22、58-69位堿基序列作為合適的反義PNA靶序

16、列，并根據(jù)這些區(qū)域的核酸序列，分別設(shè)計(jì)并合成了5條與這些基因序列互補(bǔ)的抗rpoD反義PNA（anti-rpoDPNA），并分別在碳末端將其與促進(jìn)PNA通過細(xì)胞壁的透膜肽(KFF)3K相連接，制備成抗rpoD的肽核酸-透膜肽接合物（anti-rpoDpPNAs）。采用RP-HPLC純化樣品，MALDI-TOF測(cè)定所有合成anti-rpoDpPNAs的實(shí)際分子量與理論分子量相符，純度大于90％。然后，在4株包括敏感和耐藥的大腸埃希菌上檢測(cè)a

17、nti-rpoDpPNA的抑菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，作用于rpoDmRNA1-11和2-13序列區(qū)域的anti-rpoD-PNA-CPPs顯示良好的抑菌效果，其MIC值在25?M。該結(jié)果提示，基因rpoD的mRNA起始編碼子區(qū)域?yàn)镻NA反義抑制作用的敏感部位，同時(shí)提示anti-rpoDpPNA對(duì)起始編碼子AUG的反義抑制是其發(fā)揮抑菌作用所必須的。
　　為了進(jìn)一步增強(qiáng)anti-rpoD-PNA的反義抗菌效果與透膜效率，我們對(duì)作用于rpoD

18、mRNA1-12序列區(qū)的anti-rpoDpPNA進(jìn)行了優(yōu)化設(shè)計(jì)，主要包括在PNA與CPP間加入甘氨酸，將CPP與anti-rpoDPNA氮端相連接，將anti-rpoDPNA碳末端2個(gè)核苷酸截去形成截短體，anti-rpoDPNA結(jié)合靶序列負(fù)向移位，以及將透膜肽(RXR)4XB與anti-rpoDPNA氮末端相連接等。結(jié)果發(fā)現(xiàn)分別與(RXR)4XB和(KFF)3K連接的具有相同反義PNA序列，即anti-rpoDPNA01的截短體的P

19、NA0106和PNA0103顯示出良好的廣譜抑菌效果。anti-rpoDpPNA0106抑制敏感和多藥耐藥大腸埃希菌的MIC濃度為5～25?M，抑制多藥耐藥鮑曼不動(dòng)桿菌、多藥耐藥弗氏志賀菌、多藥耐藥腸炎沙門氏菌、銅綠假單胞菌和產(chǎn)超廣譜?-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌的MIC濃度分別為1.25、2.5、12.5、12.5和30?M。anti-rpoDpPNA0103抑制敏感和多藥耐藥大腸埃希菌的MIC濃度為6.25～25?M，抑制多藥耐藥鮑曼不動(dòng)

20、桿菌、多藥耐藥弗氏志賀菌、多藥耐藥腸炎沙門氏菌、銅綠假單胞菌和產(chǎn)超廣譜?-內(nèi)酰胺酶肺炎克雷伯菌的MIC濃度分別為2.5、5、>25和40?M。
　　上述結(jié)果表明，rpoDmRNA可以作為廣譜反義抗菌的靶基因，該基因1.1區(qū)域內(nèi)的第1-10編碼區(qū)序列為理想的反義抗菌靶序列區(qū)，篩選獲得的反義PNA0103和PNA0106對(duì)多種革蘭氏陰性耐藥致病菌具有抑制作用，其抑菌效果較強(qiáng)。
　　2.anti-rpoDpPNA遞藥體系的篩選