槲皮素抑制膠質(zhì)疤痕愈合的分子生物學(xué)機制的探究.pdf

1、背景和目的：
　　 槲皮素是一種廣泛存在于自然界（如蔬菜、水果及其他日常飲食）中的具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤和神經(jīng)保護作用的黃酮類化合物。大量研究表明槲皮素可通過改變反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞基因的表達來保護神經(jīng)元和減少神經(jīng)變性疾病的發(fā)生發(fā)展。因此，探究槲皮素對劃痕愈合的影響及其作用機制，將為我們后續(xù)研究槲皮素和反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦損傷中的作用奠定基礎(chǔ)，也為膠質(zhì)疤痕的形成機理提供新的研究思路。
　　 膠質(zhì)成熟因子，是由142個

2、氨基酸殘基組成的分子量為17 kDa的蛋白質(zhì)小分子，主要包括膠質(zhì)成熟因子-β(GMFB)和膠質(zhì)成熟因子-γ(GMFG)。GMFB主要表達分布于脊椎動物的大腦中，在神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞的生長和分化中起了重要的調(diào)節(jié)作用。GMFG，膠質(zhì)成熟因子家族的一個新成員，其基因序列和氨基酸序列和GMFB具有高度的相似性（在大鼠中，其基因水平的相似度達71％;氨基酸序列的相似度達78.9％），故將其命名為膠質(zhì)成熟因子-γ。GMFG的表達分布與GMFB的表達分

3、布不同，GMFG高度表達分布在造血系統(tǒng)（包括粒細(xì)胞性白血病和淋巴細(xì)胞性白血?。?、胸腺、脾臟、胚胎的肝臟及肺臟中，GMFG的進化與有分化和增殖潛能的造血免疫系統(tǒng)的進化同步。GMFG在神經(jīng)和大腦中的表達分布并不比其他組織中高，大鼠大腦中GMFG的mRNA可在大腦海馬CA3區(qū)的錐體細(xì)胞中檢測到[5]。GMFG在大鼠（鼠齡為E14-P1）的視網(wǎng)膜的內(nèi)限膜中也可被探測到，對其膠質(zhì)細(xì)胞的生長和分化可能起了重要作用。但是到目前為止，GMFG在大腦中詳

4、細(xì)的表達分布狀況及其功能仍然未知。
　　 近年來更多的研究聚焦于槲皮素的抗腫瘤作用，研究表明槲皮素可誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞的凋亡如白血病細(xì)胞、胰腺癌細(xì)胞等?？谇击[狀上皮癌，是世界上第六種最常見的惡性腫瘤;外科手術(shù)和放療/化療是治療口腔鱗狀上皮癌的最佳選擇方案，但口腔上皮癌細(xì)胞的多重耐藥性是其化療根治和化療失敗的一大難題。P-glycoprotein(P-gp)是介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞多重耐藥的主要機制之一，大量研究顯示槲皮素能抑制P-gp的表達

5、，降低多種腫瘤細(xì)胞的耐藥性，如人胰腺癌細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞;而是否槲皮素可以抑制口腔鱗狀上皮癌的生長，并通過降低P-gp的表達來逆轉(zhuǎn)其多重耐藥性目前尚不清楚。
　　 本研究分為以下三個部分:
　　 第一部分、槲皮素抑制膠質(zhì)疤痕愈合的分子生物學(xué)機制的探究
　　 一、實驗?zāi)康模航Ⅲw外星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移模型，探究槲皮素對劃痕愈合及其對膠質(zhì)疤痕中星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和遷移的影響，并探究其可能的分子生物學(xué)機制，為膠質(zhì)疤痕的

6、治療尋找一種潛在的藥物。
　　 二、實驗方法：
　　 1.星形膠質(zhì)細(xì)胞GFAP染色鑒定原代星形膠質(zhì)細(xì)胞經(jīng)GFAP免疫熒光染色后進行純度鑒定，陽性細(xì)胞達95％以上，符合實驗要求。
　　 2.體外星形膠質(zhì)細(xì)胞遷移模型的建立及應(yīng)用實驗分為三組，第一組為對照組(C組)，僅作劃痕處理;第二組為劃痕加DMSO處理組（D組），第三組為劃痕加槲皮素處理組（Q組）;劃痕操作如下，于35mm培養(yǎng)皿的蓋上劃出縱橫交錯的九道格，將蓋置于

7、膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)皿下面，用10μL加樣器槍頭沿蓋上的格橫豎各劃九道，換液除去脫落細(xì)胞，然后置于5％的CO2培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每組三個培養(yǎng)皿。在低倍鏡下拍照，并通過NIS Elements D軟件測量劃痕的寬度，以此作為該視野劃痕的寬度計算其遷移指數(shù)。遷移指數(shù)的計算公式為:Ix=3Lx/(LC+LD+LQ)。
　　 3.Western blot通過Western blot分析槲皮素對caspase-3、ERK1/2及p-ERK1/2蛋

8、白表達的影響;然后通過Gel-Pro analyzer(Alpha Innotech Corp，CA)分析軟件，對蛋白的表達狀況進行定量分析（目的蛋白/內(nèi)參蛋白）。
　　 4.Live/Dead染色培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞用PBS洗三遍以后，取200μL Live/Dead混合標(biāo)記液加入到各組培養(yǎng)皿中進行避光染色15min后，于激光共聚焦顯微鏡下觀察活細(xì)胞（呈綠色）和損傷細(xì)胞（呈紅色）的情況。
　　 5.Click-iT

9、EdU Test培養(yǎng)成熟的星形膠質(zhì)細(xì)胞半量換液，加入1mL含20μmol/LEdU的全培養(yǎng)液。將其置于37℃，5％的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液，加入1mL3.7％甲醛室溫下固定15min，用3％ BSA洗兩遍。然后再加入1mL0.5％Triton X-100室溫下孵育20min;用3％ BSA洗兩遍。然后加入0.5mL Click-iT反應(yīng)混合液，室溫下避光振蕩30min。用3％ BSA洗一遍;然后再加入1mL1×Hoech

10、st33342反應(yīng)液室溫下避光反應(yīng)30min。用PBS清洗兩次后，激光共聚焦顯微鏡下拍照分析并計算其增殖細(xì)胞百分比，以上實驗隨機重復(fù)3次。
　　 6.細(xì)胞周期分析將處理后的星形膠質(zhì)細(xì)胞用0.25％胰酶37℃消化5min，收集的懸浮細(xì)胞室溫下1500 r/min離心5min。棄上清，加入250μL胰酶溶液（A液），混勻后，室溫下反應(yīng)10min。然后再加入200μL的胰酶抑制劑和核糖核酸酶的混合液（B液），混勻后，室溫下反應(yīng)10mi

11、n。最后加入200μL冰冷的PI染液(C液)，混勻后，4℃避光反應(yīng)10min;然后將其在3h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測。
　　 三、實驗結(jié)果：
　　 1.槲皮素對體外星形膠質(zhì)細(xì)胞劃痕愈合的影響與對照組相比，槲皮素(50μmol/L)能明顯抑制劃痕的愈合，在6h時就有明顯的統(tǒng)計學(xué)差異，而DMSO對劃痕的愈合無影響;在第72h時C組和D組的部分視野已開始愈合。
　　 2.槲皮素對星形膠質(zhì)細(xì)胞生存的影響LIVE/DEAD染色后

12、鏡下觀察C組、D組和Q組的細(xì)胞均為綠色活細(xì)胞，生長狀況良好。這說明該濃度槲皮素（50μmol/L）對星形膠質(zhì)細(xì)胞沒有毒性作用，對其死亡無影響。
　　 3.槲皮素對星形膠質(zhì)細(xì)胞凋亡的影響免疫熒光染色和Western blot檢測顯示槲皮素（50μmol/L）對凋亡蛋白酶的表達無影響，以上研究表明槲皮素（50μmol/L）對星形膠質(zhì)細(xì)胞的凋亡無影響。
　　 4.槲皮素對星形膠質(zhì)細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期的影響與對照組相比，槲皮素能明

13、顯抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖，對照組星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖比例是槲皮素處理組的10倍以上。槲皮素處理24h后，G1期星形膠質(zhì)細(xì)胞的比例由82.04％增加到92.06％，而S期和G2期的比例相應(yīng)降低。以上數(shù)據(jù)表明槲皮素可通過抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞DNA的合成來抑制其增殖。
　　 5.槲皮素可通過降低ERK1/2的磷酸化水平來抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的遷移與對照組相比，第24h時槲皮素(50μmol/L)能使ERK1/2的磷酸化水平降低大約45％，此外，

14、槲皮素對ERK1/2磷酸化水平的影響有一定的時間和濃度依賴性。隨時間的變化，ERK1/2的磷酸化水平逐漸降低，第12h時ERK1/2的磷酸化水平降到了最低，此后開始回升。在0-100μmol/L的濃度范圍內(nèi)，隨著槲皮素的濃度增加，ERK1/2的磷酸化水平逐漸降低。
　　 U0126可明顯降低ERK1/2的磷酸化水平，并且可明顯抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞體外劃痕的愈合。用磷酸酶抑制劑，釩酸鹽，維持槲皮素處理過的星形膠質(zhì)細(xì)胞的ERK1/2的磷

15、酸化水平，發(fā)現(xiàn)釩酸鹽可逆轉(zhuǎn)槲皮素抑制劃痕愈合的效應(yīng)。
　　 四、實驗結(jié)論：
　　 本研究發(fā)現(xiàn)低濃度的槲皮素（50μmol/L）對膠質(zhì)劃痕中星形膠質(zhì)細(xì)胞的生存和凋亡無影響，槲皮素可通過抑制膠質(zhì)劃痕中星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖和遷移來抑制劃痕的愈合。
　　 第二部分、膠質(zhì)成熟因子在大鼠大腦中的表達狀況分析及其功能的初步探究
　　 一、實驗?zāi)康模悍治鯣MFG蛋白在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達狀況，比較GMFB和GMFG在大

16、腦組織和細(xì)胞中的表達和分布狀況，探究GMFG在星形膠質(zhì)細(xì)胞中的功能。
　　 二、實驗方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)
　　 原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng)、大鼠神經(jīng)元的培養(yǎng)、大鼠膠質(zhì)瘤9L和C6細(xì)胞系的培養(yǎng)。
　　 2.人膠質(zhì)瘤及其正常大腦組織樣品所有人膠質(zhì)瘤及其正常大腦組織樣品（共22例）均取自于南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院神經(jīng)外科。
　　 3.免疫熒光染色用細(xì)胞免疫熒光染色檢測GMFB和GMFG在原代星形膠質(zhì)細(xì)胞及

17、神經(jīng)元上的表達情況。
　　 4.Western blot通過Western blot檢測GMFB和GMFG在原代星形膠質(zhì)細(xì)胞及大腦組織中表達狀況。
　　 5.免疫組化通過免疫組化染色探究GMFB和GMFG在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達分布狀況。
　　 6.Real-time PCR通過熒光定量PCR檢測GMFB和GMFG在不同細(xì)胞系或不同組織中基因水平上的變化7.免疫共沉淀通過免疫共沉淀探究并分析星形膠質(zhì)細(xì)胞中GFAP和

18、GMFB/GMFG相互作用。
　　 三、實驗結(jié)果：
　　 1.GMFB和GMFG在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)中的表達狀況分析本研究從基因、蛋白及細(xì)胞水平上第一次證明了GMFG在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達及存在，免疫熒光染色顯示GMFB主要表達分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核中，幾乎所有細(xì)胞均表達GMFB;而GMFG表達分布于星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)中，GMFG在細(xì)胞質(zhì)中的表達以細(xì)胞核為中心向細(xì)胞質(zhì)的四周放射。
　　 2.GMFB

19、和GMFG在大鼠大腦中的區(qū)域依賴性分布免疫組化結(jié)果表明，GMFB在大腦中分布廣泛，尤其是在海馬的錐體細(xì)胞中表達最為明顯。相比之下，GMFG并不是在整個大腦中都可探測到，僅可在部分細(xì)胞中探測到，GMFG在海馬的錐體細(xì)胞中表達最強，其次是大腦髓質(zhì)層和大腦的基底核，在大腦皮質(zhì)的表達最弱。
　　 3.GMFB和GMFG在大鼠大腦中的年齡依賴性表達GMFB的mRNA表達水平明顯高于GMFG，GMFB的mRNA表達水平從出生后的第7天開始明

20、顯下降，出生后的第8個月達到最低;而GMFG的mRNA表達水平在出生后的第7天達到了最高峰，此后開始下降，出生后的第8個月達到最低。在出生后的第7天GMFB蛋白的表達量達到了高峰，隨后開始降低，1個月后趨于穩(wěn)定;而GMFG蛋白的表達量在出生后一直降低。
　　 4.GMFB在星形膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞上的表狀況分析結(jié)果顯示GMFB在大鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞核上的表達增強，在細(xì)胞質(zhì)中的表達無明顯變化。前面的研究已證實隨著中樞神經(jīng)系統(tǒng)的成熟，

21、GMFB在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的表達逐漸減弱。膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為一種未成熟和未分化的膠質(zhì)細(xì)胞在其細(xì)胞核上呈現(xiàn)出高表達。因此推測可能存在一個負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制，在星形膠質(zhì)細(xì)胞的成熟和GMFB的表達之間存在重要的調(diào)節(jié)作用。正因為這種負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制導(dǎo)致了GMFB在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系9L和C6細(xì)胞核上的高表達。
　　 5.GMFG在星形膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞上表狀況分析結(jié)果顯示膠質(zhì)瘤細(xì)胞中GMFG無論是在mRNA水平上還是蛋白水平上的表達狀況均明顯低于其在星

22、形膠質(zhì)細(xì)胞上的表達水平。除此之外，通過免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)GMFG在膠質(zhì)瘤細(xì)胞上的表達強度明顯低于其在星形膠質(zhì)細(xì)胞上的表達強度。研究顯示GMFG和GFAP之間確實存在某種相互作用，而GMFB和GFAP之間無該種相互作用。
　　 6.GMFG在人腦膠質(zhì)瘤標(biāo)本上的表達狀況分析免疫組化實驗結(jié)果顯示4/5(80％)的正常腦組織標(biāo)本呈陽性，4/7(57.14％)Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本呈陽性。統(tǒng)計學(xué)結(jié)果顯示Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本的陽性率顯著低于正常腦組

23、織標(biāo)本(x2=6.5，p＜0.05，費舍爾確切概率法);在陽性標(biāo)本中，不管細(xì)胞類型如何，GMFG在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中均呈現(xiàn)陽性。Western blot結(jié)果顯示，與正常大腦組織標(biāo)本相比，Ⅳ級膠質(zhì)瘤組織標(biāo)本的表達水平明顯下降。
　　 四、實驗結(jié)論：
　　 本研究從基因、蛋白及細(xì)胞水平上第一次證明了GMFG在大鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的存在，比較了GMFB和GMFG在大鼠大腦中的組織分布狀況，發(fā)現(xiàn)其在大鼠大腦中的分布具有區(qū)域依賴性，其表

24、達具有時間依賴性;此外，本研究發(fā)現(xiàn)GMFB和GMFG在正常的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞和膠質(zhì)瘤細(xì)胞系之間表達狀況的差異，并進一步證實了其在人正常的腦組織和Ⅳ級膠質(zhì)瘤標(biāo)本上的表達狀況之間的差異。本研究第一次提出了GMFB在膠質(zhì)細(xì)胞中表達狀況的負(fù)反饋調(diào)節(jié)機制，并對GMFG在膠質(zhì)瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)化中的作用做了初步探究。
　　 第三部分、槲皮素對KBV細(xì)胞及其耐藥機制的影響
　　 一、實驗?zāi)康模禾骄块纹に貙δ烷L春新堿的口腔鱗狀上皮癌KBV細(xì)胞系侵

25、襲、遷移、增殖及其凋亡的影響，進一步分析槲皮素降低耐藥相關(guān)蛋白P-gp表達后KBV細(xì)胞對長春新堿的敏感性。
　　 二、實驗方法：
　　 1.細(xì)胞培養(yǎng)人KBV細(xì)胞細(xì)胞系采用含10％的胎牛血清、200nmol/L VCR的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，置于37℃、5％的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
　　 2.Transwell體外遷移實驗將饑餓12-24h后的KBV細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，離心棄培養(yǎng)液，PBS洗1-2遍，用含0.1

26、％ FBS的1640配養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至于5x104。取200μL細(xì)胞懸液加入Transwell上室，含10％FBS的1640培養(yǎng)基500μL加入下室。37℃5％的CO2培養(yǎng)12h后，用棉簽擦去上室內(nèi)細(xì)胞，多聚甲醛固定10分鐘，0.1％結(jié)晶紫室溫孵育10min，清水漂洗3遍以上。Transwell小室翻過來底面朝上置顯微鏡下觀察、拍照并計數(shù)。
　　 3.Transwell體外侵襲實驗將用1640做1∶5稀釋后的Matr

27、igel涂于Insert細(xì)胞生長面，150-200μL/cm2，37℃作用30分鐘，備用。將饑餓12-24h后的KBV細(xì)胞制備細(xì)胞懸液，離心棄培養(yǎng)液，PBS洗1-2遍，用含0.1％ FBS的DMEM配養(yǎng)基重懸細(xì)胞，將細(xì)胞密度調(diào)至于5x104個/cm2。取200μL細(xì)胞懸液加入Transwell上室，取含10％ FBS的1640培養(yǎng)基500μL加入下室。37℃，5％的CO2培養(yǎng)36h后，用棉簽擦去Matrigel和上室內(nèi)細(xì)胞，多聚甲醛固定

28、10分鐘;0.1％結(jié)晶紫室溫染色10分鐘，清水漂洗3遍以上。Transwell小室翻過來底面朝上置顯微鏡下觀察拍照計數(shù)。
　　 4.μTT測定細(xì)胞的生長取5×103個細(xì)胞接種于96孔板上，待細(xì)胞貼壁后將培養(yǎng)基移去，分別加入200μL含濃度為0、25、50、75和100μmol/L槲皮素的10％ FBSRPMI-1640培養(yǎng)基，培養(yǎng)12h、24h和48h后，每孔中加入20μL5mg/ml的3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二

29、苯基四氮唑溴鹽(MTT)繼續(xù)培養(yǎng)4h，然后用200μL加樣槍將液體小心地移去，每孔加入二甲基亞砜(DMSO)150μL，微振蕩器振蕩10min，用SpectraMaxM-5多功能酶標(biāo)儀在490nm波長下測光密度值。每組設(shè)6個重復(fù)孔，重復(fù)三次試驗。
　　 5.Click-iT Edu檢測將處理好的KBV半量換液，加入1mL含20μmol/L EdU的全培養(yǎng)液，其最終工作濃度為10μmol/L。將其置于37℃，5％的CO2培養(yǎng)箱中培

30、養(yǎng)24h后棄去培養(yǎng)液，加入1mL3.7％甲醛室溫下固定15min，棄去固定液，用3％ BSA洗兩遍。然后再加入1mL0.5％ Triton X-100室溫下孵育20min;棄去通透液，用3％ BSA洗兩遍。然后加入0.5mL Click-iT反應(yīng)混合液，室溫下避光振蕩30min。棄去反應(yīng)液，用3％ BSA洗一遍。然后再加入1mL1X Hoechst33342反應(yīng)液室溫下避光反應(yīng)30min。用PBS清洗兩次后，激光共聚焦顯微鏡下拍照分析并

31、計算其增殖細(xì)胞百分比，以上實驗隨機重復(fù)3次。
　　 6.細(xì)胞周期分析將收集的懸浮細(xì)胞室溫下400g離心5min。棄上清，加入250μL胰酶溶液（A液），用手指輕彈將其混勻，室溫下反應(yīng)10min。然后再加入200μL的胰酶抑制劑和核糖核酸酶的混合液（B液），用手指輕彈將其混勻，室溫下反應(yīng)10min。最后加入200μL冰冷的PI染液（C液）用手指輕彈將其混勻，4℃避光反應(yīng)10min。然后將其在3h內(nèi)上流式細(xì)胞儀檢測，以上實驗隨機重復(fù)

32、3次。
　　 7.細(xì)胞凋亡分析將消化的KBV細(xì)胞用PBS洗滌細(xì)胞兩次，收集1×106個細(xì)胞，加入500μL的Binding Buffer重懸細(xì)胞。加入5μL的Annexin V-FITC混勻后;再加入5μL的Propidium Iodide，混勻;室溫避光反應(yīng)5-15min。在染色后1h內(nèi)上流式細(xì)胞儀進行檢測，以上實驗隨機重復(fù)三次。
　　 8.Western blot Western blot分析槲皮素對caspase-

33、3、Bax、Bcl-2及P-gp蛋白表達的影響，然后通過Gel-Pro analyzer(Alpha Innotech Corp, CA)分析軟件，對蛋白的表達狀況進行定量分析（目的蛋白/內(nèi)參蛋白）。
　　 三、實驗結(jié)果：
　　 1.MTT檢測槲皮素對KBV細(xì)胞生長能力的影響低濃度(25μmol/L)的槲皮素處理12h、24h和48h后，KBV細(xì)胞的生長抑制率分別為（13.76±2.679）％，（14.63±4.262）

34、％和（16.80±3.876）％,統(tǒng)計學(xué)分析發(fā)現(xiàn)該濃度槲皮素的生長抑制效應(yīng)并未隨著時間增長而升高。槲皮素對KBV細(xì)胞的生長抑制效應(yīng)隨著槲皮素濃度的上升而增高，第48h時，75μmol/L槲皮素的生長抑制率為50％，因此其IC50值為75μmol/L。
　　 2.槲皮素可抑制KBV細(xì)胞遷移和侵襲能力與對照組相比，處理組遷移侵襲比例顯著降低，25μmol/L，50μmol/L和100μmol/L槲皮素處理組其遷移細(xì)胞百分比分別為60

35、.14％，30.40％和13.93％(P＜0.01);侵襲細(xì)胞百分比分別為38.57％、22.27％和5.12％(P＜0.01)。
　　 3.槲皮素對KBV細(xì)胞增殖及其細(xì)胞周期的影響50μmol/L槲皮素處理24h后，對照組增殖細(xì)胞百分比為槲皮素處理組的兩倍。50μmol/L槲皮素處理24h后，G1期細(xì)胞的比例明顯升高，由42.41％升高到52.66％(P＜0.01)，S期細(xì)胞的比例明顯降低，由52.24％降低到43.04％(P

36、＜0.01)。
　　 4.槲皮素對KBV細(xì)胞凋亡的影響與對照組相比，槲皮素處理組其凋亡細(xì)胞百分比顯著升高，且有一定的濃度依賴性，槲皮素濃度為100μmol/L時其凋亡細(xì)胞百分比為17.53％。
　　 5.槲皮素對Bcl-2、Bax及caspase-3蛋白表達的影響槲皮素處理24h后，隨著槲皮素濃度的升高，抗凋亡蛋白Bcl-2和35kDa的caspase-3蛋白表達量逐漸降低，而抑凋亡相關(guān)蛋白Bax和17kDa的cleav

37、ed caspase-3蛋白表達量逐漸升高，均有一定的濃度依賴性，以上數(shù)據(jù)表明槲皮素可通過線粒體途徑來誘導(dǎo)KBV細(xì)胞的凋亡。
　　 6.槲皮素對耐藥相關(guān)蛋白P-glycoprotein表達的影響用0、25、50、75及100μmol/L槲皮素處理KBV細(xì)胞24h后，Western blot檢測顯示P-gp的表達量發(fā)生明顯改變，隨著槲皮素濃度的升高，P-gp的表達量逐漸降低，有一定的濃度依賴性。與對照組相比，25、50、75及10

38、0μmol/L槲皮素處理KBV細(xì)胞24h后，P-gp的表達量分別為91％、83％、66％和45％。
　　 7.槲皮素可通過下調(diào)P-gp表達來增強KBV細(xì)胞對長春新堿的敏感性與對照組和長春新堿單獨處理組相比，聯(lián)合用藥組能顯著降低P-gp的表達量，而與槲皮素處理組相比卻無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。與單獨用藥組和對照組相比，聯(lián)合用藥組能顯著降低其增殖細(xì)胞百分比，并且其凋亡比例也顯著升高。與對照組和單獨處理組相比，聯(lián)合用藥組KBV細(xì)胞的遷移和侵襲