應(yīng)用巢式PCR進行申克孢子絲菌的分子生物學(xué)鑒定.pdf

1、目的：探討孢子絲菌病的分子生物學(xué)快速診斷方法。 材料及方法：一、實驗材料1.實驗菌株：臨床分離的申克孢子絲菌38株(其中中國15株，日本n株，美國4株，委內(nèi)瑞拉3株，阿根廷2株，澳大利亞、南非、法國各1株，mtDNA型1～24均包括其中)?？巳崮钪榫啄钪榫?、馬爾尼菲青霉、煙曲霉、疣狀瓶霉、甄氏外瓶霉、皮炎外瓶霉、新型隱球菌、須癬毛癬菌、卡氏枝孢霉菌種各1株，均為中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病研究所保存菌株。Ceratocystismi

2、nor2株，均為日本Tokyo醫(yī)學(xué)真菌研究所保存菌株。 2.實驗動物：10只BALB/c小鼠，實驗動物體重22g～24g，8～10W，購自遼寧省實驗動物中心。小鼠被分為兩組，1組雄性5只，1組雌性5只。 3.臨床標本：9個經(jīng)真菌培養(yǎng)確診的人孢子絲菌病的病理活檢標本來自于本科。 二、實驗試劑1.基因組DNA提取主要試劑基因組DNA提取液CTAB(hexadecyltrimethylammoniumbromide，十

3、六烷基三甲基溴化銨)。 2.PCR主要試劑2.1真菌特異性外層引物SS1和SS22.2真菌特異性內(nèi)層引物SS3和SS43.動物實驗試劑3.1標準菌株ATCC10268申克孢子絲菌菌懸液3.2組織基因組DNA提取液SDS3.3蛋白酶K 三、實驗方法1.DNA的提取利用CTAB方法提取來自于不同地區(qū)臨床分離的申克孢子絲菌38株[含有24個線粒體DNA(mitochondrialDNA，mtDNA)型]及10株其它臨床上重要的

4、致病真菌以及2株與申克孢子絲菌相似的真菌(Ceratocystisminor)基因組DNA，調(diào)整100ng/μL，其中將ATCC10268DNA濃度稀釋為(100ng/μL～0.01pg/μL)以備PCR擴增。 2.動物模型制備：將申克孢子絲菌菌株在沙氏葡萄糖肉湯液態(tài)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，過濾除去菌絲，然后計數(shù)孢子數(shù)量，用生理鹽水稀釋至所需濃度，分別于8只小鼠的尾背4點皮下注射各0.05mL(包含7.5×105cfu)，2只小鼠尾背4點

5、皮下注射0.05mL生理鹽水做陰性對照，35d后接種部位局部取材。 3.臨床和動物模型組織標本的基因組DNA提?。?.1g的臨床組織標本或感染小鼠組織標本加入400μLDNA提取液混勻，55℃過夜，加熱至95℃10min以滅活蛋白酶K，再液氮冷凍后加熱5個循環(huán)，用CTAB法(同上)提取真菌基因組DNA備用。 4.巢氏PCR4.1一層PCR：應(yīng)用真菌特異性外層引物SS1和SS2對來自于不同地區(qū)臨床分離的申克孢子絲菌38株(

6、含有24個mtDNA型)及不同濃度的標準菌株ATCC10268的DNA、標準菌株ATCC10268制備的8個動物模型標本、9個臨床病理活檢標本，10株其它臨床上重要的致病真菌以及2株與申克孢子絲菌相似的真菌進行PCR擴增。 4.1.1PCR反應(yīng)體系：總體積為50μlTaKaRaTaq(1.25U/μl)0.3μl10×PCRbuffer(含mg2+)5μldNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mmol/L)4μ

7、lSS1(20μmol/μL)1μlSS2(20μmol/μL)1μltemplateDNA(100ng/μL)5μl4.1.2PCR反應(yīng)條件：95℃5min預(yù)變性40個循環(huán)：95℃1min變性、56℃1min復(fù)性、72℃1min延伸，后延伸72℃5min。 4.2電泳PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分數(shù)為2％瓊脂糖凝膠上電泳觀察并照相。 4.3目的片段回收將PCR產(chǎn)物利用PCR產(chǎn)物回收試劑盒對305bp的目的片段進行回收、純化。

8、 5.巢氏PCR擴增：應(yīng)用真菌特異性內(nèi)層引物SS3和SS4對回收DNA，進行PCR擴增。 5.1.1PCR反應(yīng)體系如下：反應(yīng)總體積50μlTaKaRaTaq(1.25U/μL)0.3μl10×PCRbuffer(含mg2+)5μldNTP(dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mmol/L)4μlSS3(20μmol/μL)1μlSS4(20μmol/μL)1μltemplateDNA(100ng/μL)5μl5.1.

9、2PCR反應(yīng)體條件如下：同上。5.2電泳PCR產(chǎn)物在質(zhì)量分數(shù)為2％瓊脂糖凝膠上電泳觀察并照相。 結(jié)果：1.臨床分離的38株申克孢子絲菌(含有24個mtDNA型)一次PCR和巢氏PCR均各擴增出一條帶型，分別為305bp和152bp片段，其他真菌均為陰性。 2.對不同濃度的標準菌株ATCC10268的DNA進行巢式PCR擴增結(jié)果：外層引物PCR在大于或等于5pg時可擴增出305bp片段，而內(nèi)層巢式PCR在在大于或等50fg

10、時可擴增出152bp片段，敏感度提高100倍。 3.8個動物感染模型以及9個臨床已經(jīng)過真菌培養(yǎng)證明感染申克孢子絲菌的人體活檢標本均擴增出152bp的片段。 結(jié)論：1.本實驗特異性引物結(jié)合巢氏PCR具有明顯的特異性。 2.實驗也對PCR與巢氏PCR敏感性進行了對比研究，說明特異性引物結(jié)合巢氏PCR具有高敏感的特點。 3.從病變組織中直接檢測孢子絲菌DNA的可能性提供依據(jù)，為有效、快速、準確地鑒定申克孢子絲菌