膜莢黃芪不定根培養(yǎng)及苯丙氨酸解氨酶(PAL)基因的克隆與功能鑒定.pdf

1、黃芪作為一種常用中藥，廣泛應(yīng)用于復(fù)方制劑中。為了黃芪資源的可持續(xù)利用，本文利用組織培養(yǎng)手段研究了影響膜莢黃芪不定根生長(zhǎng)的因素，結(jié)果發(fā)現(xiàn)不定根在B5培養(yǎng)基中加入30 g/L白糖和2 mg/L IBA的條件下生長(zhǎng)良好;生物反應(yīng)器培養(yǎng)過(guò)程中，在5L氣升式反應(yīng)器中（3L培養(yǎng)基）接入鮮物重30 g，長(zhǎng)約2 cm的不定根，注入0.10 vvm空氣時(shí)，可獲得大量的不定根。有效成分分析結(jié)果表明，膜莢黃芪不定根中多糖含量明顯高于栽培膜莢黃芪，總皂苷和黃酮

2、含量與三年生栽培膜莢黃芪無(wú)顯著差異，但是顯著高于一年生栽培膜莢黃芪。
　　苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL, EC4.3.1.5)是植物苯丙烷次生代謝途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶和限速酶，包括類黃酮在內(nèi)的一切含苯丙烷骨架的物質(zhì)都是由該代謝途徑直接或間接生成。PAL作為初級(jí)代謝和苯丙烷次生代謝的紐帶，不僅對(duì)于植物的生理代謝和抗逆性有很重要的作用，對(duì)醫(yī)藥、生物化工領(lǐng)域也具有重大的現(xiàn)實(shí)意義與應(yīng)用價(jià)值。

3、
　　本文利用已知的PAL基因不同植物的氨基酸序列比較分析得保守序列，設(shè)計(jì)出簡(jiǎn)并引物，應(yīng)用RT-PCR和RACE技術(shù)，首次成功地從膜莢黃芪中克隆出了PAL基因，命名為AmPAL，并在Genebank登錄(EF567076)。AmPAL全長(zhǎng)為2650 bp，含有一個(gè)完整的2154 bp開(kāi)放讀碼框。生物信息學(xué)分析表明，AmPAL是植物苯丙氨酸解氨酶家族的一個(gè)新成員，推測(cè)其編碼718個(gè)氨基酸的多肽，分子量為78.05 KDa，等電點(diǎn)為5

4、.96，與豆科植物已知的PAL氨基酸序列的同源并且核酸和氨基酸序列相似性都大于80％。Southern雜交分析表明，AmPAL在膜莢黃芪基因組中是一個(gè)單拷貝基因。
　　為了了解和鑒定膜莢黃芪PAL基因的功能及生物學(xué)活性，用基因重組技術(shù)構(gòu)建了pQE30-AmPAL原核表達(dá)載體，繼而轉(zhuǎn)入大腸桿菌M15表達(dá)6×His融合蛋白。結(jié)果表明重組蛋白進(jìn)行了大量表達(dá)，通過(guò)Ni-NTA瓊脂柱純化，分子量為78 KDa左右，每克細(xì)胞（干物重）純化出4

5、5 mg6×His-AmPAL。酶活性測(cè)定表明，攜帶6個(gè)組氨酸的重組蛋白并不影響蛋白質(zhì)的功能，可保持AmPAL原有的生物活性，AmPAL比活性為6500 U/mg蛋白質(zhì)，對(duì)L-本丙氨酸的米氏常數(shù)Km值為3.35×10-4mM/L。
　　在此基礎(chǔ)上，構(gòu)建了植物表達(dá)載體pBI121-AmPAL，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化到模式植物擬南芥中，經(jīng)過(guò)分子鑒定證明基因已整合到基因組DNA分子中并在轉(zhuǎn)錄水平上進(jìn)行了表達(dá)，酶活性測(cè)定結(jié)果表明轉(zhuǎn)基因植株