離子液體中膠紅酵母苯丙氨酸解氨酶催化性質研究.pdf

1、離子液體(Ionic Liquids，IL)，是在室溫或室溫附近(＜100℃)由有機陽離子和有機或無機陰離子構成并且呈液態(tài)的鹽類化合物。離子液體具有諸多優(yōu)點，因此受到極大的關注，被開發(fā)和應用到諸多領域，尤其是在生物催化方面被廣泛關注，目前已經被應用于木瓜蛋白酶、脂肪酶、纖維素酶、β-葡萄糖苷酶等酶催化反應中，但在苯丙氨酸解氨酶(PAL)催化應用方面尚未見報道。本文通過研究不同離子液體對PAL催化活性的影響，篩選出能顯著提高PAL活性的離

2、子液體，并進一步研究了PAL在該離子液體中各種催化性能。
　　1)膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa) PAL的部分純化通過玻璃珠對膠紅酵母(Rhodotorula mucilaginosa)進行破壁，提取粗酶液，并在冰浴中利用40％飽和度的硫酸銨進行蛋白沉淀，采用透析法除去硫酸銨，進而通過PEG20000對酶液進行濃縮，并通過Sepharose4B凝膠柱、DEAE-Sepharose FF離子交換柱進行了

3、部分純化。結果表明:PAL純化倍數(shù)為22.71，酶活回收率為35.5％。對部分純化后的酶液進行SDS-PAGE凝膠電泳得到三個條帶，表明得到部分純化的PAL。
　　2)離子液體的篩選研究了不同濃度的1-乙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([EMIM]BF4)、1-丙基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([PMIM]BF4)、1-丁基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([BMIM]BF4)、1-丁基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([BMIM]PF6)、1-戊基-3

4、-甲基咪唑四氟硼酸鹽([PtMIM]BF4)、1-戊基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([PtMIM]PF6)、1-已基-3-甲基咪唑四氟硼酸鹽([HMIM]BF4)、1-己基-3-甲基咪唑六氟磷酸鹽([HMIM]PF6)8種離子對苯丙氨酸解氨酶(PAL)催化L-苯丙氨酸(L-phe)生成反式肉桂酸的影響，結果表明，與單一的緩沖液反應體系相比，發(fā)現(xiàn)在反應體系中加入55％的疏水性離子液體[HMIM]PF6，酶活性提高了33.5％。
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5、離子液體[HMIM]PF6對PAL活性和穩(wěn)定性的影響采用單因素法，研究了PAL在[HMIM]PF6中最適反應條件、穩(wěn)定性和動力學參數(shù)。結果表明，與單一水相相比，苯丙氨酸解氨酶(PAL)在(水/[HMIM]PF6)兩相中的最適反應溫度和pH發(fā)生相對偏移，分別為40℃和7;溫度耐受性和pH穩(wěn)定性有相對改善，但變性劑耐受性無多大改變。在55％[HMIM]PF6反應體系中的Km比單一緩沖液體系要低，而且最大反應速率vmax也要比單一緩沖體系高。