貂、狐、貉源犬瘟熱病毒分離鑒定與分子生物學(xué)特性研究.pdf

1、犬瘟熱病毒(CDV)屬于副粘病毒科(family Paramyxoviridae)麻疹病毒屬(genusMorbillivirus)成員，常引起貂、狐、貉等毛皮動(dòng)物、犬以及熊貓、虎等珍稀動(dòng)物大批發(fā)病，由于犬瘟熱(CD)感染性強(qiáng)、發(fā)病急、死亡率高，以及與人類亞急性硬化性全腦炎(subacute sclerosing panencephalitis，SSPE)和多發(fā)性硬化癥(multiple sclerosing，MS)可能存在聯(lián)系，一直成

2、為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)，但毛皮動(dòng)物CDV病原學(xué)、病理學(xué)、診斷、免疫學(xué)等研究目前尚不深入.2006年6月至10月間，山東、河北、遼寧等地毛皮動(dòng)物群大面積暴發(fā)犬瘟熱.本研究在該病流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)、剖檢病變及病理組織學(xué)研究基礎(chǔ)上，從臨床病料中分離獲得5個(gè)CDV分離株，并進(jìn)一步從該病毒基因特征、Real-time RT-PCR快速診斷方法和DNA疫苗免疫效果等方面進(jìn)行了分子生物學(xué)特性研究，為毛皮動(dòng)物群CD防控奠定基礎(chǔ)。 1.貂、狐、貉

3、群犬瘟熱病理學(xué)研究 對(duì)2006年6月至10月間山東、河北等地區(qū)的部分毛皮動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生疑似犬瘟熱的疫情進(jìn)行了流行病學(xué)、臨床表現(xiàn)以及剖檢變化觀察和分析，并對(duì)采集的病料進(jìn)行了病理學(xué)研究：結(jié)果表明，這起疫情主要是由攜帶CDV的貉、貂調(diào)運(yùn)而促進(jìn)病毒傳播感染引起.發(fā)病動(dòng)物割檢病變以全身臟器出血性變化為特征，病情及病變嚴(yán)重程度依次為貉>狐貍>水貂.通過對(duì)發(fā)病狐貍、貉、水貂的肺臟、肝臟、腦、腎臟、膀胱等臟器病理學(xué)比較，在病變程度上水貂與狐貍、

4、貉有差異.同一種動(dòng)物，依病程、病型及有無并發(fā)癥等因素，病理學(xué)變化也存在差異。 2.貂、狐、貉源犬瘟熱病毒的分離鑒定與生物學(xué)特性研究 對(duì)流行病學(xué)調(diào)查、臨床癥狀檢查、病理剖檢以及病理組織學(xué)檢查診斷為CDV陽性的發(fā)病貉、狐貍和水貂，取其肝，脾、肺、淋巴結(jié)及腦混合研磨處理后，分別接種能穩(wěn)定表達(dá)犬信號(hào)淋巴細(xì)胞活性分子(SLAM)的Vero-DST細(xì)胞進(jìn)行病毒分離，并通過電鏡形態(tài)觀察、RT-PCR測(cè)，理化特性測(cè)定和人工感染試驗(yàn)進(jìn)行鑒

5、定.結(jié)果為：5份不同來源的病料接種Vero-DST細(xì)胞，36-96h后均產(chǎn)生明顯CPE；病毒TCID50分別為10-5.2～-7.3/ml；電鏡觀察可見多形態(tài)病毒粒子，大小為110～500nm； CDV特異性引物RT-PCR檢測(cè)5個(gè)分離毒株均為陽性；除雞、鵝紅細(xì)胞呈微弱陽性外，其余均未見血凝作用；對(duì)乙醚、氯仿和甲醛敏感，對(duì)酸、堿和熱的抵抗力比較弱；5個(gè)病毒分離株對(duì)乳鼠的LD50分別為2×10-3.8～-4.8/ml，對(duì)實(shí)驗(yàn)兔無致病性，對(duì)

6、貉有明顯致病性作用，從而均鑒定為犬瘟熱病毒(CDV)，分別命名為CDV/SD/RD06/HT-P(貉源)、CDV/SD/RD06/THD1(貉源)、CDV/SD/M06/HD(貂源)、CDV/SD/M06/LN(貂源)和CDV/SD/F06/HB(狐源)。 3.貂、狐、貉源犬瘟熱病毒不同分離株H和N基因序列分析 用RT-PCR方法對(duì)分離的5個(gè)CDV分離株的H基因和N基因進(jìn)行了擴(kuò)增，并分別將其克隆到PGEMT-Vector

7、,進(jìn)行序列測(cè)定.然后與GenBank中己報(bào)道的CDV毒株相比較.結(jié)果為：(1)H基因5個(gè)分離株H基因nt序列同源性均達(dá)到97.5％以上，與國內(nèi)疫苗株chn同源性為90.5～91.8％.5個(gè)CDV分離株H基因推導(dǎo)的aa序列同源性比較表明：HT-P與THD1的aa同源性為100％，二者與其他分離毒株間aa序列同源性差別大，分別為87.9％～99.1％：與chn同源性普遍較低，為89.7％～91.8％.而chn與Onderstepoort、C

8、onvac有著很高的同源性關(guān)系(nt同源性分別為96.8％和97.2％；aa同源性分別為97.1％和95.6％).(2)N基因5個(gè)分離株N基因nt序列同源性均達(dá)到94.5％以上，HT-P與THD1的同源性最高(99.8％).國內(nèi)疫苗株chn與分離株的nt序列同源性普遍較低(90.9～93.5％)，而與疫苗株Onderstepoort的nt同源性高，達(dá)到97.1％.從N蛋白aa序列看，分離株之間除HT-P、THD1與HD aa序列同源性較

9、高(99.0％以上)外，其他分離株之間aa同源性低.而Chn與Onderstepoort有著很高的同源性關(guān)系，同源性比例達(dá)97.3％.本研究結(jié)果提示，HD和LN潑病區(qū)域相距較遠(yuǎn)，但具有較高的同源性，而與HB具有相對(duì)較低的nt同源性，提示野毒株在易感動(dòng)物上可能存在種屬差異。此外，分離毒株H和N蛋白免疫原性可能與疫苗株有較大差別，可能與CD免疫失敗有關(guān)。 4.犬瘟熱病毒實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)方法的研究 按照CDV N基

10、因序列，設(shè)計(jì)合成了特異性引物和探針，經(jīng)各反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了CDV的Real-time熒光定量RT-PCR檢測(cè)技術(shù)，用20pmol/mL的引物濃度各1uL和20pmol/mL的探針濃度0.3uL,獲得的熒光信號(hào)最強(qiáng)，曲線平滑.敏感度為1.24×10-3ng/mL的病毒RNA；與NDV、AIV、NiPV等RNA病毒不發(fā)生交又反應(yīng).試驗(yàn)重復(fù)性的變異系數(shù)(CV)分別為2.3％、2.5％和4.2‰對(duì)采集的57份臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)，熒光RT-PC

11、R檢測(cè)陽性檢出率為93％(53/57)，而BIOINDIST BIT RAPID CDV試劑盒、常規(guī)RT-PCR陽性檢出率分別為70.2％(40/57)和71.9％(41/57)，與BIOINDIST試劑盒和常規(guī)RT-PCR的符合率分別為77.2％和78.9％，而BIOINDIST試劑盒與常規(guī)RT-PCR符合率達(dá)98.2％.結(jié)果表明，本研究建立的檢測(cè)CDV的熒光RT-PCR方法具有快速、特異、敏感、可定量，并可同時(shí)檢測(cè)大量樣品等優(yōu)點(diǎn)，能

12、用于CDV感染的早期診斷和海關(guān)檢疫。 5.貉源犬瘟熱病毒H、F和N基因真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定 將貉源CDV分離株的H、F和N (N1，N2)基因經(jīng)RT-PCR擴(kuò)增后，連接到pMD18-T載體，對(duì)比測(cè)序結(jié)果表明各基因序列正確，并且符合閱讀框規(guī)則。然后將各基因亞克隆到真核表達(dá)栽體pIRESlneo中，經(jīng)PCR方法和限制酶酶切鑒定成功構(gòu)建了四種重組真核表達(dá)質(zhì)粒，分別命名為pIRES T-N1、pIRES T-N2、pIRES

13、 T-H、pIRES T-F.用構(gòu)建的真核重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染VERO-DST細(xì)胞，用抗CDV陽性血清進(jìn)行Western blot分析，結(jié)果表明，各重組質(zhì)?？梢员磉_(dá)相應(yīng)的目的蛋白。 6.貉源犬瘟熱病毒H、F和N基因表達(dá)質(zhì)粒DNA免疫保護(hù)效率研究 本研究將pIRES T-H、pIRES T-F、pIRES T-N1和pIRES T-N2四個(gè)真核表達(dá)質(zhì)粒作為基因疫苗，單獨(dú)或混合分組對(duì)42只小鼠和21只斷奶貉進(jìn)行了動(dòng)物免疫試驗(yàn)，對(duì)免疫

14、的實(shí)驗(yàn)貉進(jìn)行了攻毒保護(hù)實(shí)驗(yàn)，并與chn弱毒疫苗、進(jìn)口CDV-CPV二聯(lián)疫苗進(jìn)行了比較。結(jié)果為： (1)小鼠免疫試驗(yàn) 采用構(gòu)建的基因疫苗免疫小鼠2次后開始有抗體反應(yīng)，免疫第3次后小鼠血清中抗CDV ELISA抗體和中和抗體水平與免疫前和空載體陰性對(duì)照相比明顯增高(p<0.05).從ELISA抗體滴度比較，四種基因疫苗聯(lián)合免疫組(簡(jiǎn)稱“四基因組”)與pIRES T-H組、pIRES T-F組和pIRES T-N1+pIRES

15、 T-N2組差異不顯著，但其中和抗體水平明顯高于單一基因疫苗組(p<0.05).chn組中和效價(jià)與四基因組差異不顯著，但ELISA滴度明顯高于四基因組。CDV-CPV組ELISA抗體滴度和中和抗體滴度均明顯高于各基因疫苗組(p<0.05)。 (2)貉免疫保護(hù)試驗(yàn) 基因疫苗免疫貉后，血清中CDV ELISA抗體滴度(OD650值)組間差異不顯著，但是四基因組比單獨(dú)免疫組有較高抗體滴度。講基因疫苗經(jīng)3次免疫貉后，四基因組與其

16、他3組相比中和滴度較高。四基因組與chn組、CDV-CPV組免疫后都有抗體升高，但是chn組上升較低，CDV-CPV組上升較高.CDV-CPV組中和抗體水平明顯高于四基因組2個(gè)滴度.攻毒實(shí)驗(yàn)表明，除四基因組外，pIRES T-H、pIRES T-F、pIRES T-NI+pIRES T-N2組各有不同程度死亡.Chn組死亡1只，而CDV-PPV組均存活。 剖檢結(jié)果可以看出，免疫組自然死亡貉中，pIRES T-H組、pIRES T

17、-F組和pIREST-N1+pIRES T-N2組表現(xiàn)中度至嚴(yán)重病理變化，而chn組死亡1只貉病變程度相對(duì)較低.試驗(yàn)結(jié)束實(shí)施安樂死的貉均呈輕微至中度變化。排毒檢測(cè)結(jié)果表明，試驗(yàn)貉中除了CDV-PPV組的2只和四基因組中的1只一直沒有檢測(cè)到CDV特異核酸外，其他樣品都在不同采樣時(shí)段或采集的不同樣品中檢測(cè)到。其中血液中檢出時(shí)間最早，其次為眼結(jié)膜、直腸拭子。眼結(jié)膜拭子的檢出率和檢出時(shí)間較直腸拭子的高，檢出時(shí)間較早。自然死亡貉組織都擴(kuò)增出了CD