生長素信號對植物生長與系統(tǒng)性獲得抗性的調(diào)控作用.pdf

1、生長素是一類參與植物發(fā)育過程的典型植物激素，這種非蛋白的簡單分子參與調(diào)控：胚的形態(tài)建成、細胞分裂與伸長、維管組織的分化、側(cè)根的起始生成、向地性和向光性等。同時，在分子水平上，生長素還調(diào)控著無數(shù)基因的表達。近年來的研究，尤其是生長素受體轉(zhuǎn)運抑制響應蛋白(transport inhibitor response protein1，TIR1)和疑似受體生長素結(jié)合蛋白(auxin binding protein1，ABP1)的發(fā)現(xiàn)，使得生長素信

2、號通路得到簡潔清晰的解析。最近的研究發(fā)現(xiàn)，水楊酸全面抑制生長素相關基因的表達，且水楊酸對生長素信號通路的抑制是水楊酸介導的抗病防衛(wèi)反應機制的一部分，說明生長素在植物防衛(wèi)過程中也起著重要作用。然而，這樣一個看似簡單的信號通路是如何參與調(diào)控植物中無數(shù)的發(fā)育過程的，生長素又是如何共同調(diào)控植物生長與防衛(wèi)的，這些問題還有待進一步解析。另外，植物非激素信號對生長與防衛(wèi)具有重要調(diào)控作用，其中，核黃素不僅可以誘導植物抗病性，還能促進植物生長。在表達軟體

3、海龜核黃素受體基因的轉(zhuǎn)基因植物中，核黃素含量下降，植物生長加快、抗病性提高，但其調(diào)節(jié)機制還不了解。本文著重研究生長素信號對植物生長和抗病性的調(diào)控作用；為了進一步探討激素信號與核黃素對植物生長發(fā)育和抗病性的不同調(diào)控作用，本文還構(gòu)建了核黃素受體與熒光蛋白的融合蛋白，產(chǎn)生了轉(zhuǎn)基因擬南芥，用于進一步研究。 1.一種生長素抑制蛋白調(diào)控煙草矮化突變體的組成性系統(tǒng)獲得抗性 植物中的系統(tǒng)獲得抗性(systematic acquired

4、resistance，SAR)是由多種激發(fā)子誘導產(chǎn)生的。在對激發(fā)子的反應過程中，錨蛋白NPR1(non-expressor of PR)的主要功能是調(diào)控植物防衛(wèi)基因的表達，這些基因包括SAR相關基因以及像hsr203和hin1這樣的過敏反應相關基因。這些基因編碼防衛(wèi)產(chǎn)物包括病程相關(pathogenesis-related，PR)蛋白、幾丁質(zhì)酶或者其它可以抵抗病原物的酶。這些產(chǎn)物共同作用來防止病原物的侵染和致病，從而使植物產(chǎn)生抗病表型。

5、因而，防衛(wèi)反應基因的表達和系統(tǒng)抗性的產(chǎn)生被認為是SAR的主要特征，在特殊環(huán)境之下，一旦植物的遺傳特性被修飾，SAR的特征就會通過繁殖變成組成性的和可遺傳的。在這種情況下，組成性表達SAR(cSAR)可以遺傳到植物的有性后代中，抗性反應基因的表達可以不依賴激發(fā)子的存在。 人們已經(jīng)應用了許多方法來修飾植物的遺傳特性和改變SAR的特性。一種植物工程方法是將防衛(wèi)調(diào)控基因融合到一個組成性表達的啟動子上，諸如花椰菜花葉病毒來源的35S啟動子

6、。遺傳突變廣泛的應用于標記包括正向及負向調(diào)控抗病反應的植物基因。一種常規(guī)的誘變方法是在植物的胚體的無性繁殖過程中，如細胞或組織培養(yǎng)和植物再生過程，對其進行無性系變異。這個過程能夠使由SAR激發(fā)子引發(fā)的植物遺傳變異穩(wěn)定下來，從而改變SAR特性的遺傳方式。 為了研究植物生長和系統(tǒng)獲得抗性的共同調(diào)控作用，我們對野生型煙草(Nicotiana tabacum)進行體細胞無性系變異處理，得到組成性表達SAR的突變體cesl-1。與野生型相

7、比，cesl-1表型矮化但卻對真菌的侵染表現(xiàn)抗性。這種突變體能組成性的表達植物抗病反應基因，但是卻不能表達植物生長途徑中的伸展素expansin基因?；亟坏倪z傳分析表明，cesl-1是在野生型位點上的單基因顯性突變。差異顯示表明，在cesl-1中存在一個與編碼生長素抑制蛋白的基因NtARP1一致的轉(zhuǎn)錄本，而野生型煙草中缺少此轉(zhuǎn)錄本。我們通過cDNA末端快速擴增(rapid amplification of cDNA ends，RACE)

8、的方法克隆到NtARP1基因，并檢測了生長素對基因表達的影響及植物中NtARP1的蛋白產(chǎn)物。將NtARP1基因進行瞬時表達，發(fā)現(xiàn)NtARP1定位在cesl-1的細胞核上.經(jīng)過吲哚乙酸IAA處理的cesl-1，其NtARP1的表達和NtARP1蛋白產(chǎn)物的產(chǎn)生均受到抑制。我們進而對NtARP1在調(diào)控煙草的生長防衛(wèi)功能上進行了研究。當突變體cesl-1中的NtARP1被沉默時，其生長恢復了野生型的表型，但是喪失了組成性表達SAR的特性。ces

9、l-1中的IAA含量低于野生型，然而，外部施用IAA可以使cesl-1中IAA含量恢復到野生型水平。實驗結(jié)果表明，存在一條生長素信號通路負向調(diào)控植物的生長而正向調(diào)控防衛(wèi)。 2.核黃素受體基因轉(zhuǎn)基因擬南芥的產(chǎn)生和鑒定 核黃素在生物體內(nèi)形成黃素單核苷酸(flavin mononucleotide，F(xiàn)MN)及黃素腺嘌呤二核苷酸(flavin adenine dinucleotide，F(xiàn)AD)，它們是黃素酶的輔酶。核黃素所形成的

10、輔酶參與機體組織維生素C抗氧化作用的呼吸電子傳遞及氧化還原過程，參與植物抗氧化及過氧化過程，從而影響氧化性損傷及后續(xù)過敏反應過程中活性氧中間體(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，而ROS是過敏細胞壞死的重要信號，能調(diào)節(jié)生長、抗病、抗蟲、抗逆，所以核黃素與植物免疫反應有關。外施核黃素可以誘導植物抗病性。植物中的核黃素水平可能對抗病防衛(wèi)和生長發(fā)育過程有影響。因此，如果能夠控制核黃素水平就能相應控制這些重要過程，

11、提高植物抗病防衛(wèi)的能力并促進植物生長發(fā)育。以此為切入點，可以研究核黃素參與的植物防衛(wèi)和生長調(diào)控的交叉點。 本實驗室已經(jīng)克隆到了中華鱉的核黃素受體(riboflavin binding protein，RfBP)基因。本研究將綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)基因融合構(gòu)建的核黃素結(jié)合蛋白(riboflavin binding protein，RfBP)基因轉(zhuǎn)入擬南芥中，來研究RfBP蛋白在植

12、物細胞內(nèi)的定位，進而研究RfBP蛋白在植物發(fā)育和防衛(wèi)信號傳導中的作用。將來自軟體海龜?shù)腞fBP基因連入植物表達載體pBI121中，用水母綠色熒光蛋白(green fluorescent protein，GFP)標記，構(gòu)建了植物重組表達質(zhì)粒pBI121-RfBP-GFP，由農(nóng)桿菌Agrobacterium tumefaciens菌株EHA105介導，轉(zhuǎn)化擬南芥生態(tài)型Columbia(Col-0)。獲得了抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因純合擬南芥植株，經(jīng)