胰島素治療通過減輕內質網應激改善2型糖尿病大鼠肝臟胰島素敏感性和脂肪沉積.pdf

1、內質網監(jiān)控蛋白質加工并保證蛋白質能準確地折疊,內質網中鈣離子穩(wěn)態(tài)的改變、蛋白質過量生成和未折疊或錯誤折疊蛋白質蓄積能引發(fā)細胞特異性內質網應激反應。內質網應激主要激活三條信號通路:未折疊蛋白反應(unfolded proteinresponse,UPR),內質網超負荷反應和固醇調節(jié)級聯反應。UPR的最初目的是適應環(huán)境的改變,通過跨膜蛋白ATF6、PERK、IRE1/XBP1轉導內質網UPR的信號,恢復內質網正常功能。但是,如果這些適應性反

2、應不能有效去除應激狀態(tài),過強或長期的內質網應激將導致細胞出現副作用,如凋亡和胰島素抵抗等。內質網應激是肥胖、胰島素抵抗和2型糖尿病之間的一種分子聯系,內質網應激可以導致胰島素受體信號的抑制,而這種抑制作用是通過IRE-1α依賴性JNK激活所致。固醇調節(jié)級聯反應是在內質網表面合成的膽固醇損耗所致,內質網應激,在內質網膜表面合成膽固醇的耗竭可激活固醇調節(jié)反應結合蛋白(SREBPs),其中,SREBP-1c是調控肝臟脂質代謝有關酶的重要轉錄因

3、子,能選擇性調控脂肪酸、甘油三酯以及糖代謝(如葡萄糖激酶)相關基因的表達水平。
　　 作為一種合成激素,胰島素能明顯促使蛋白質的合成。如果胰島素誘導合成的多肽鏈超過了內質網蛋白質的折疊能力將導致內質網正確折疊蛋白或未折疊蛋白的增加,從而引起內質網應激。那么,在1型和2型糖尿病治療中被廣泛應用的胰島素是否會引起內質網應激并因此而導致胰島素抵抗目前尚未有相關的研究證實。一些臨床研究發(fā)現胰島素治療能改善全身胰島素抵抗或抑制肝糖輸出,但

4、在動物實驗中胰島素治療對肝臟胰島素信號通路的作用及其分子機制目前不還清楚。胰島素是SREBP1的激活因子,能導致肝細胞和脂肪細胞脂肪沉積增加,但在2型糖尿病大鼠中,胰島素治療是否也會導致肝臟脂肪沉積增加也值得進一步的研究。本研究先建立2型糖尿病動物模型,給予胰島素治療,然后檢測肝臟胰島素信號通路活性、肝糖異生關鍵酶的表達、JNK活性、IRE1a/XBP1通路、BiP及SREBP1等指標的變化,探討胰島素對肝臟內質網應激和胰島素敏感性的作

5、用及其分子機制,并且研究胰島素治療對肝臟脂肪沉積的影響并探討其機制。
　　 研究目的:
　　 1.研究胰島素治療對2型糖尿病大鼠肝臟內質網穩(wěn)態(tài)的影響
　　 2.研究胰島素治療對2型糖尿病大鼠肝臟胰島素敏感性的影響及其分子機制
　　 3.觀察胰島素治療對肝臟脂肪沉積的影響并探討其分子機制
　　 1材料與方法:
　　 1.1動物模型:
　　 8周齡清潔級近交系雄性SD大鼠60只,重約2

6、00g左右,適應性喂養(yǎng)兩周后,將SD大鼠隨機分成常規(guī)飼料喂養(yǎng)組(NC,n=10)和高脂飼料喂養(yǎng)組(HFD,n=50)。分別用相應飼料喂養(yǎng)5周,第5周末禁食12小時后,HFD組大鼠腹腔內一次性注射STZ(STZ40mg/kg體重)。注射STZ三天后測非空腹血糖。非空腹血糖大于16.7mmol/L為糖尿病大鼠。將這些糖尿病大鼠隨機分為糖尿病組(DM,n=6,不給予藥物干預)、早期胰島素治療(EI,n=6,STZ注射三天后診斷為糖尿病即開始給

7、予皮下胰島素注射)、達美康治療組(GT,n=6,STZ注射三天后診斷為糖尿病即開始給予達美康灌胃治療)和晚期胰島素治療組(LI,n=6,STZ注射一月后開始給予皮下胰島素注射),正常對照組和糖尿病組大鼠給予相同體積的生理鹽水皮下注射治療,療程為三周。目標血糖為4-8mmol/L,根據血糖濃度調整胰島素和達美康的劑量。
　　 1.2腹腔葡萄糖耐量試驗
　　 胰島素和達美康治療結束兩天后進行腹腔葡萄糖耐量試驗。禁食12小時后

8、,給予大鼠腹腔注射1.5克k_1體重50％的葡萄糖。尾靜脈取血(0分鐘、30分鐘和120分鐘)作血糖和血清胰島素檢測,以葡萄糖曲線下面積和胰島素曲線下面積計算葡萄糖胰島素指數。
　　 1.3 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)
　　 肝臟總蛋白用細胞裂解液提取,14000rpm離心后取上清液分裝備用。蛋白濃度使用BCA法測定,每個樣本加入上樣緩沖液,每泳道加入約100ug蛋白。65V電泳,待溴酚藍越過濃縮膠后改

9、為200V,蛋白分離后開始轉膜,電壓110V。轉膜后6％脫脂牛奶封閉1小時,4℃過夜孵育一抗,洗膜后常溫下孵育二抗1小時,再用TBST洗膜后曝光,選取清晰的X光膠片進行圖像分析。
　　 1.4磷酸化IRS1的檢測
　　 加IRS1抗體至樣品中,4℃搖床上孵育過夜,加入0.04ml蛋白A至小cup中,4000g離心1分鐘,將免疫復合物加入小cup中,孵育10分鐘,4000g離心1分鐘,加0.5ml Binding/wash

10、 buffer至小cup中4000g離心1分鐘,加190ulElution Buffer至免疫復合物中,4000g離心1分鐘,收集液層作SDS-PEGA電泳、轉膜、孵育一抗和二抗及曝光。
　　 1.5JNK活性檢測
　　 加20ul珠子至200ul樣品中后4℃搖床上孵育過夜。4℃離心,14000g,10min。加500ul1×cell lysis buffer洗洗滌沉淀物2次,加500ul1×kinase buffer,

11、旋轉洗滌沉淀物2次,棄上清,加50ul1×kinase buffer,200MATP重懸沉淀物,4℃水浴箱內孵育30分鐘,加25ul3×SDS Sample buffer終止反應,常溫下離心30秒。收集液層作SDS-PEGA電泳、轉膜、孵育一抗和二抗及曝光。
　　 1.6肝臟甘油三酯提取
　　 100毫克肝組織在冰冷的氯仿-甲醇(體積比為2:1)溶液中手動勻漿。在室溫下孵育5小時后加氯仿,離心。收集底部沉渣、風干后在融解

12、在氯仿中,離心后收集上清夜使用酶法檢測。
　　 1.7 Real Time PCR
　　 采用Sybrgreen染料法,以β-actin為內參基因,對HIF1α和Glut1基因的mRNA表達量進行檢測,反應結束后確認Real Time PCR的擴增曲線和融解曲線,相對定量實驗需要進一步用樣品的目的基因減去管家基因測得值來校正誤差,所得結果代表樣品目的基因的相對含量。
　　 1.8統(tǒng)計分析
　　 數據用均數

13、±標準差表示,兩組間比較使用t檢驗,多組之間比較用方差分析。P<0.05為有統(tǒng)計學意義。
　　 2結果:
　　 2.12型糖尿病模型的建立
　　 為了建立2型糖尿病動物模型,本研究使用高脂飲食聯合小劑量鏈脲佐菌素。血清胰島素水平和甘油三酯在高脂飲食喂養(yǎng)5周時升高,提示SD大鼠存在胰島素抵抗。注射小劑量STZ三天后血糖水平顯著升高,研究結束是糖化血紅蛋白也明顯升高,除此之外,這些糖尿病大鼠也表現出對胰島素促泌劑有反

14、應,這些結果說明了本研究誘導出了一種具有2型糖尿病典型代謝特點的大鼠模型。
　　 2.2胰島素對2型糖尿病大鼠的治療效果
　　 為了研究胰島素治療的作用機制,胰島素的治療活性在動物模型中被調查。早期胰島素治療組糖代謝指標如空腹血糖和糖化血紅蛋白以及甘油三酯水平均明顯降低。為了評價胰島素敏感性,在胰島素治療后檢測大鼠腹腔注射葡萄糖耐量試驗,計算葡萄糖-胰島素指數,結果顯示早期治療組大鼠葡萄糖-胰島素指數明顯降低,這些結果說

15、明了胰島素治療改善了糖尿病大鼠的胰島素敏感性。晚期胰島素治療組對空腹血糖和糖化血紅蛋白,甘油三酯以及葡萄糖-胰島素指數也有一定的治療效果,但療效不如早期胰島素治療組。
　　 2.3胰島素改善肝臟胰島素作用
　　 肝臟組織的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化胰島素底物受體1被用來評價肝臟的胰島素敏感性。免疫沉淀和免疫印跡方法檢測肝臟細胞的總蛋白IRS1絲氨酸307位點的磷酸化水平在糖尿病大鼠中明顯升高,但胰島素治療后,絲氨酸磷酸化IRS

16、1水平明顯降低,這說明了胰島素信號通路的改善。
　　 為了評價胰島素的活性,檢測肝臟PEPCK和G6P蛋白表達水平。結果顯示PEPCK和G6P蛋白表達水平在糖尿病組大鼠中升高,胰島素治療后降低。在早期胰島素治療組和晚期胰島素治療組絲氨酸磷酸化IRS1、PEPCK和G6P蛋白表達水平之間的差異沒有達到統(tǒng)計學意義,但早期和晚期治療組均降低絲氨酸磷酸化IRS1、PEPCK和G6P蛋白表達水平,這表明了胰島素治療改善了肝臟胰島素的反應性

17、。
　　 2.4胰島素治療對肝臟JNK活性的影響
　　 為了進一步闡明IRS1的絲氨酸磷酸化,肝臟的JNK活性被檢測。JNK活性使用JNK1蛋白水平的變化及其激酶活性來評價。磷酸化c-Jun水平在糖尿病大鼠組中明顯升高,經過胰島素治療后顯著降低,而且早期胰島素治療組與晚期胰島素治療組比較,磷酸化c-Jun水平下降的更明顯。JNK的三種亞單位之一的JNK1蛋白水平在糖尿病大鼠肝臟升高,而胰島素治療后JNK1蛋白水平下降。這

18、說明糖尿病大鼠肝臟的JNK活性升高,但是胰島素治療后其活性顯著降低。
　　 2.5胰島素治療對IRE1α/XBP—1通路的影響
　　 IRS1的絲氨酸磷酸化由JNK介導,而JNK由IRE1α激活。為了理解JNK的激活,肝臟組織IRE1α/XBP-1通路的變化被檢測。結果發(fā)現,糖尿病組IRE1α的蛋白表達水平明顯升高,而在胰島素治療組中IRE1α蛋白表達水平降低。IRE1α的底物XBP-1也被檢測。糖尿病組剪切和未剪切的X

19、BP-1蛋白表達水平明顯升高,而在胰島素治療組中剪切和未剪切的XBP-1蛋白表達水平降低。另外,在早期胰島素治療和晚期胰島素治療組IRE1α和剪切和未剪切的XBP-1蛋白表達水平并沒有明顯不同。這說明了糖尿病組中IRE1α/XBP-1通路活性明顯升高,而胰島素治療后這一通路的活性下調。
　　 2.6胰島素對內質網應激的影響
　　 生理濃度的胰島素能誘導培養(yǎng)的鼠腹膜巨噬細胞內質網應激,而內質網應激與胰島素抵抗相關。為了評價

20、胰島素治療對動物模型內質網穩(wěn)態(tài)的影響,內質網應激的標志物免疫球蛋白結合蛋白(BIP)的蛋白表達水平被檢測。肝臟的BIP蛋白表達水平在糖尿病大鼠中明顯升高,但胰島素治療后BIP蛋白表達水平明顯下降,而且與晚期胰島素治療組比較,早期胰島素治療組BIP蛋白表達水平下降得更明顯。這說明了胰島素治療并沒有增加內質網應激而是減輕了糖尿病大鼠肝臟的內質網應激。
　　 2.7胰島素對2型糖尿病大鼠肝臟脂肪沉積的治療效果
　　 為了評價胰

21、島素對2型糖尿病大鼠肝臟脂肪沉積的治療效果,檢測肝臟標本的甘油三酯,結果發(fā)現與對照比較,糖尿病組大鼠肝臟的甘油三酯含量增加,經過胰島素治療后,早期胰島素治療組和晚期胰島素治療組大鼠肝臟的甘油三酯含量下降,說明了胰島素治療減輕了2型糖尿病大鼠模型肝臟的脂質沉積。
　　 2.8胰島素治療對2型糖尿病大鼠肝臟SREBP1蛋白表達的影響
　　 為了研究胰島素治療減輕了2型糖尿病大鼠模型肝臟的脂質沉積的機制,本研究檢測了肝臟脂肪代

22、謝調控的一個重要轉錄因子SREBP1蛋白表達的變化。糖尿病組大鼠與正常對照組比較SREBP1蛋白水平表達明顯增加,經過胰島素治療后SREBP1蛋白水平表達下降。并且與晚期胰島素治療組比較,早期胰島素治療組SREBP1蛋白水平表達的下降的程度更明顯。這提示糖尿病組大鼠肝臟內質網固醇調節(jié)級聯反應被激活,經過胰島素治療組該反應下調。
　　 2.9胰島素治療對2型糖尿病大鼠肝臟PPARa蛋白表達的影響
　　 PPARa是肝臟脂肪

23、代謝調控的另一個重要因素,并且也對SREBP1的表達有負調控作用。糖尿病組大鼠與正常對照組比較PPARa蛋白水平表達增加,經過胰島素治療后PPARa蛋白水平表達進一步增加。這些結果提示糖尿病組和胰島素治療組大鼠PPARa被激活。
　　 2.10胰島素治療對2型糖尿病大鼠肝臟缺氧反應的影響
　　 缺氧與脂肪肝關系密切,缺氧誘導因子1a調控SREBP1的表達,本研究檢測了介導缺氧反應的分子mRNA或蛋白表達水平的變化。糖尿病

24、組大鼠與正常對照組比較HIF—1a mRNA和及其下游信號分子Glut1mRNA表達增加,經過胰島素治療后下降,說明了胰島素治療是糖尿病大鼠肝臟的缺氧得到了部分緩解。
　　 內質網分子伴侶ORP150能被缺氧特異性誘導,本研究檢測了ORP150蛋白水平的變化,糖尿病組大鼠與正常對照組比較ORP150蛋白表達增加,經過胰島素治療后ORP150表達下降,說明了胰島素治療改善了糖尿病大鼠肝臟缺氧狀態(tài)。
　　 結論: