歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒候選疫苗規(guī)?；苽浼捌涿庖哐芯?pdf

1、豬繁殖與呼吸綜合征（Porcine Reproductive And Respiratory Syndrome，PRRS）是一種感染率高的豬傳染病，嚴重影響著世界養(yǎng)豬產業(yè)。PRRS病毒分為歐洲型PRRSV（基因1型）以及美洲型PRRSV（基因2型），二者基因同源性相差40％左右。豬繁殖與呼吸綜合征臨床癥狀主要表現(xiàn)為母豬繁殖障礙，斷奶仔豬普遍發(fā)生肺炎、生長遲緩以及死亡率增加。世界上很多國家一直應用弱毒疫苗和滅活疫苗來預防 PRRSV。但是

2、，弱毒疫苗的應用，易造成病毒返祖，滅活疫苗則免疫原性一般很難有效的預防PRRSV。因此針對具有基因多樣性特點的PRRSV，需要研發(fā)出一種安全有效的PRRS疫苗。我國PRRSV主要流行毒株為美洲型高致病性毒株，但近幾年在我國多個省份相繼分離到了歐洲型 PRRS毒株，歐洲型PRRSV的出現(xiàn)應該引起我們的關注。我國目前市面上的豬繁殖與呼吸綜合征疫苗均為美洲型，美洲型的PRRS疫苗對歐洲型 PRRSV基本無交叉免疫保護性，因此需要研發(fā)出一種安全

3、有效的歐洲型PRRS疫苗。
　　豬圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type2，PCV2）是引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的主要病原。主要分為PCV-1和PCV-2兩種血清型。加拿大1991年在世界范圍內首次報道PMWS，到目前為止該病現(xiàn)已波及世界上很多國家，是被全球公認的危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病之一，在中國PCV2在

4、豬群中流行也十分嚴重。因此，研發(fā)一種安全有效的疫苗是解決PCV2流行問題的關鍵。
　　目的：本研究開展了歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒候選疫苗的制備和免疫研究，通過利用微載體生物反應器技術制備實驗室構建的歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒疫苗，并通過豬體免疫實驗對其免疫效果進行評價。
　　內容：
　　1.篩選出增殖能力強的種子細胞及種毒，建立種子細胞庫及種病毒庫。
　　2.通過細胞條件、感染條件、生產

5、參數(shù)進行重組痘苗病毒疫苗制備條件優(yōu)化。
　　3.通過微載體生物反應器技術建立分批式培養(yǎng)、半間歇式培養(yǎng)、灌注式培養(yǎng)三種生產工藝，進行歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒疫苗的制備。
　　4.利用微載體生物反應器制備的歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒疫苗進行豬體免疫研究。
　　方法：
　　1.種子細胞庫及種毒庫建立
　　通過細胞傳代、細胞感染、滴度測定等方法，篩選出安全無致瘤性的BHK-21細胞及適合生

6、產的歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒rVTT-ORF2-EUO3O5毒株，建立種子細胞庫及種毒庫。
　　2.重組痘苗病毒疫苗制備條件優(yōu)化
　　通過細胞條件優(yōu)化和感染條件優(yōu)化確定一套可用于細胞增殖和病毒擴增的生產控制條件。再通過研究溫度、pH、轉速等不同的調控參數(shù)在培養(yǎng)過程中對細胞和病毒收益的影響，進一步優(yōu)化調控參數(shù)，為大規(guī)模細胞培養(yǎng)和病毒增殖提供有效的參數(shù)。
　　3.歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒候選疫苗

7、制備
　　通過結合重組痘苗病毒疫苗優(yōu)化后的數(shù)據(jù)結果進行生物反應器生產工藝流程的制定，并通過生產過程中葡萄糖和乳酸中間的關系對細胞增殖的影響選出最佳生產工藝。并對生物反應器所制備疫苗進行質量檢測，疫苗品質是否符合《中華人民共和國獸藥典》第三部的要求。
　　4.歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒候選疫苗豬體免疫研究
　　通過利用生物反應器制備的以歐洲型PRRSV經典株LV株的ORF3和ORF5基因以及PCV2的ORF2

8、基因為基礎構建的重組痘苗病毒（rVTT-ORF2-EU-O3O5）疫苗進行豬體免疫實驗，檢測其各項免疫指標，分析重組痘苗病毒疫苗的免疫效果。
　　結果：
　　1.通過致瘤性實驗，證明了BHK-21種細胞的安全、純凈；通過種子細胞、種毒的產毒比較，驗證了種細胞的增殖及產毒優(yōu)勢，達到了預期的目的；通過PCR鑒定、WB鑒定，證明了歐洲型PRRSV、PCV2重組痘苗病毒，可以表達外源基因，形態(tài)上與天然痘苗病毒無差異；通過篩選，成功建

9、立了種子細胞庫和種毒庫，凍存種子細胞16株，凍存種毒10株。
　　2.通過細胞條件優(yōu)化，最終確定以10%血清(Hyclone)濃度的DMEM培養(yǎng)基進行細胞階段的培養(yǎng)基；通過感染條件優(yōu)化，最終確定以0.1MOI的感染劑量和2%血清濃度的維持液作為病毒感染階段的感染條件；通過生產參數(shù)優(yōu)化，最終確定細胞增殖階段參數(shù)：溫度為37℃、pH=7.3及M=80r/min。感染階段參數(shù)：溫度為35℃、pH=7.1及M=40r/min。
　　

10、3.通過利用微載體生物反應器技術建立了分批式培養(yǎng)、半間歇式培養(yǎng)和灌注式培養(yǎng)三種生產方式；根據(jù)營養(yǎng)物質及代謝物質對細胞增殖的影響，確定灌注式培養(yǎng)是最適合疫苗制備的生產工藝；本實驗制備的歐洲型 PRRSV、PCV2重組痘苗病毒疫苗，質量符合《中華人民共和國獸藥典》第三部疫苗標準。
　　4.通過豬體免疫實驗，歐洲型PRRSV、PCV2重組痘病毒候選疫苗免疫組，均能在35d能夠有效的誘導豬體產生特異免疫應答，且中和抗體效價可達1:18.表

11、明重組痘病毒疫苗可以誘導機體產生體液免疫應答；歐洲型PRRSV、PCV2重組痘病毒候選疫苗免疫組細胞因子，T淋巴細胞增殖實驗等結果顯著高于野毒及PBS對照組，表明重組痘病毒疫苗可以誘導機體產生細胞免疫應答；攻毒保護實驗中，疫苗免疫組體溫顯著低于對照組，且體溫均低于40℃無發(fā)熱臨床癥狀表現(xiàn)。病毒載量和病理切片結果表明在病毒入侵時重組痘苗病毒疫苗可以提供良好保護性。
　　結論：
　　1.成功篩選出種子細胞和種毒，并建立了種子細胞