家兔骨形態(tài)發(fā)生蛋白-7（BMP-7）cDNA的克隆與表達(dá).pdf

1、本研究主要目的是對(duì)家兔BMP-7基因的結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行分析，為研究BMP-7基因在胚胎的發(fā)生和發(fā)育以及其它生殖生理過程的作用提供參考。主要得到以下一些結(jié)論： 1)結(jié)合數(shù)據(jù)庫已有的兔BMP-7基因部分編碼序列，采用RT-PCR與RACE技術(shù)，從家兔腎臟組織中克隆到一條長(zhǎng)1654 bp包含了家兔BMP-7基因大部分cDNA的序列(GenBank：EU004072：EF583950；EU599645)，該基因序列含有信號(hào)肽段除外的其它區(qū)段

2、(缺少第1位氨基酸的前肽和成熟蛋白)；446bp長(zhǎng)的3’非翻譯序列(3’UTR)。其中，417bp，編碼139個(gè)氨基酸殘基的成熟肽CDS，其編碼蛋白的理論分子量為15.6kDa，理論等電點(diǎn)(PI)為8.04。該序列將已有的序列向5’和3’端分別延伸了395 bp和640 bp。 2)序列對(duì)比表明，克隆的家兔BMP-7基因CDS部分(1205 bp)人、小鼠的對(duì)應(yīng)序列的相似性分別為91.89％、89.32％，預(yù)測(cè)的氨基酸序列相似性

3、分別為96.51％、96.01％。家兔BMP-73'UTR長(zhǎng)446bp，具有2個(gè)轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)(AAUAAA)位點(diǎn)和poly(A)11與人、小鼠、牛、豬BMP-7 mRNA 3'UTR的相似性分別50.30％、41.45％、47.84％和57.91％。推測(cè)的家兔BMP-7成熟蛋白有BMPs特有的7個(gè)位置固定的半胱氨酸殘基和FGF-B家族指紋。因此，我們成功地克隆了BMP-7的大部分cDNA序列。另外，家兔BMP-7 3'UTR區(qū)轉(zhuǎn)錄終止信

4、號(hào)的可選擇性可能與基因轉(zhuǎn)錄后調(diào)控有關(guān)。 3)對(duì)家兔BMP-7基因的體內(nèi)表達(dá)情況進(jìn)行了分析，發(fā)現(xiàn)BMP-7基因在2月齡家兔體內(nèi)許多組織中都表達(dá)。其中，BMP-7基因在心、脾組織以低豐度表達(dá)，在肺、脊髓、十二指腸以中等豐度表達(dá)，在肝、腎、腦中以高豐度表達(dá)。 4)將家兔BMP-7基因的成熟肽段克隆入pET32a原核表達(dá)載體后，成功構(gòu)建了家兔BMP-7基因的原核表達(dá)系統(tǒng)pET32a-BMP-7/BL21(DE3)和pET32a-

5、BMP-7/BL21(DE3)PlysS。表達(dá)的融合蛋白質(zhì)大小約為33.2kDa，包括了15.6kDa的家兔BMP-7目的蛋白和17.6kDa的pET32a表達(dá)載體蛋白。根據(jù)目的蛋白的表達(dá)量，優(yōu)化了IPTG誘導(dǎo)pET32a-BMP-7/BL21(DE3)表達(dá)的適宜條件。低溫(20℃～30℃)條件下，IPTG誘導(dǎo)pET32a-BMP-7/BL21(DE3)表達(dá)時(shí)，IPTG濃度不可過低，而為減少包涵體的形成，以26℃～30℃，0.1mM I