胸腺肽alpha-1長(zhǎng)效注射微球的研究.pdf

1、胸腺肽α1(thymosinα1，簡(jiǎn)稱(chēng)Tα1)是含有28個(gè)氨基酸的酸性多肽，具有乙?；陌被恕Ｋ钤缡怯膳Ｐ叵僦刑崛〉囊环N稱(chēng)為胸腺組分5中分離出來(lái)的多肽，普遍存在于哺乳動(dòng)物的各種組織細(xì)胞中，具有極強(qiáng)的提高免疫功能的活性。它可誘導(dǎo)T細(xì)胞表面標(biāo)志的產(chǎn)生，誘導(dǎo)包括巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子、干擾素和白細(xì)胞介素等淋巴因子的產(chǎn)生，從而發(fā)揮調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的作用。已有的研究表明，在A(yíng)IDS、乙型肝炎和丙型肝炎患者中，Tα1表達(dá)水平低于正常水平，而在腫瘤

2、患者中有高水平的表達(dá)。因此，Tα1有可能在許多疾病狀態(tài)中發(fā)揮一定的作用。臨床上常應(yīng)用于慢性乙型肝炎、丙型肝炎等病毒感染、腫瘤(如黑色素瘤、肺癌、白血病、鱗狀上皮細(xì)胞癌和結(jié)腸癌等)、以及免疫缺陷病人的輔助治療效果較為顯著。并可作為疫苗增強(qiáng)劑使用。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)胸腺肽的研究多數(shù)集中在生物學(xué)功能和應(yīng)用方面，并取得很大進(jìn)展，但在藥物劑型方面的研究很少，未見(jiàn)有緩釋劑型的報(bào)道。然而Ta1在體內(nèi)易被降解失活，體內(nèi)半衰期很短(1.5-2h)，多次皮下注

3、射給藥才能獲得理想的療效，這制約了利用的前景。本課題設(shè)計(jì)采用體內(nèi)可生物降解的高分子材料聚乳酸一聚羥基乙酸嵌段共聚物(PLGA)將Ta1包被成微球，一次給藥可使藥效持續(xù)四周，從而提高用藥質(zhì)量和病人的順應(yīng)性。 我們首先研究了復(fù)乳法(w/o/w)制備Ta1-PLGA微球的制備工藝及其影響因素。通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)考察了制備復(fù)乳的攪拌速度、外水相聚乙烯醇(PVA)濃度、油相PLGA濃度、內(nèi)外水相比例、外水相的滲透壓以及PLGA的平均分子量

4、等因素對(duì)微球形態(tài)、平均粒徑和包封率的影響。結(jié)果表明制備復(fù)乳的攪拌速度、PVA濃度、PLGA濃度、外水相的滲透壓都對(duì)微球的外觀(guān)和粒徑有顯著影響。微球形態(tài)和粒徑是微球釋藥調(diào)控的重要因素，微球粒徑越小，突釋效應(yīng)越明顯。通過(guò)增加外水相的滲透壓我們可以得到高包封率(80％以上)的微球，此外PLGA濃度、PVA濃度對(duì)包封率也有較大影響。體外釋放實(shí)驗(yàn)證明，采用低分子量PLGA制備的微球其降解速度明顯加快，藥物的累積釋放也顯著增加。外水相含有5％的Na

5、Cl所制備的微球表面致密，累積釋放可達(dá)80％以上，符合零級(jí)釋放模式。外水相含10％的Glucose，累積釋放也可達(dá)80％以上，體外釋放符合Riger-Peppas模型。 考慮到油水界面可能會(huì)對(duì)藥物活性有影響，我們又進(jìn)行了S/O/O法制備微球工藝的研究。這種方法可以避免藥物在油水界面聚集，有助于藥物活性的保持。這種工藝的關(guān)鍵是多肽的微粉化，我們利用藥物與PEG6000共溶后冷凍干燥，使用有機(jī)溶劑洗去PEG，即得到Tα1微粉。為了減

6、少藥物的突釋效應(yīng)我們?cè)谔幏街幸肓薢n2+，由于的Zn2+可與Tα1形成復(fù)合物，成功的降低了藥物的突釋。由于S/O/O法沒(méi)有使用水性介質(zhì)，藥物在外油相中不溶解，因此微球的包封率高。體外釋放試驗(yàn)表明用PLGA平均分子量為34，000的PLGA(RESOMER(R)503H)制備的微球，微球的體外釋放曲線(xiàn)呈典型的三相：突釋釋相、時(shí)滯相和緩釋相。但時(shí)滯相較長(zhǎng)有時(shí)可達(dá)2～3周，緩釋相累積釋放較少。而用PLGA平均分子量14，000則時(shí)滯相不明顯

7、，緩釋相的累積釋放高于40％，說(shuō)明PLGA的平均分子量是微球體外釋放時(shí)滯相和緩釋相的主要影響因素。處方工藝優(yōu)化后的PLGA微球突釋效應(yīng)控制在了25％以下，突釋后的累積釋放高于55％，體外釋藥均符合零級(jí)釋放方程。 體外的生物活性測(cè)定中，針對(duì)Tα1具有促進(jìn)T細(xì)胞亞群成熟分化的特點(diǎn)，采用CCK-8法，以酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在490nm波長(zhǎng)處測(cè)定淋巴細(xì)胞的吸收度A490-630值，以630nm為參考波長(zhǎng)，計(jì)算活細(xì)胞數(shù)量，考察藥物的生物活性。實(shí)

8、驗(yàn)發(fā)現(xiàn)微球在制備后的活性都比較高，各制備工藝均較好的保留了藥物的活性。體外釋放一周后處方W/O/W(NaCL)和S/O/O剩余的藥物活性顯著降低，分別為58.98±5.8％和67.07±2.5％而處方W/O/W(glucose)則較好的保持了藥物活性，一周后藥物活性為101.8±20.4％。 體內(nèi)藥效學(xué)研究中采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)大鼠給與Tα1微球后所產(chǎn)生的CD4+、CD8+因子的量，根據(jù)CD4+/CD8+的比值變化評(píng)價(jià)藥物作用，結(jié)