靶向肝癌干細(xì)胞的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的研究.pdf

1、肝癌是一種惡性腫瘤，惡性程度高，預(yù)后差。中國(guó)是各種肝癌的高發(fā)地，2012年全國(guó)每分鐘6人確診癌癥，其中肝癌發(fā)病率排名第二[1]。在全球，我國(guó)是肝癌發(fā)生的第一大國(guó)，其發(fā)病率占全球55％，死亡率占全球45％，中國(guó)目前每年約有32萬(wàn)例肝癌患者死亡。我國(guó)肝癌患者不僅總數(shù)世界第一，發(fā)病率也是世界第一。中國(guó)是乙肝大國(guó)，我國(guó)的肝癌患者大多在乙肝肝硬化的基礎(chǔ)上發(fā)展而來(lái)，高危發(fā)病人群基數(shù)極大[2]。目前的肝癌治療手段無(wú)法從根本上改善肝癌的預(yù)后，亟待研究更

2、有效的治療方法用于肝癌的治療。
　　 腫瘤干細(xì)胞的存在已經(jīng)得到越來(lái)越多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的支持[3-7]，腫瘤干細(xì)胞是腫瘤組織中一類具有干細(xì)胞特性的腫瘤細(xì)胞，腫瘤的耐藥、復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和增生均與之密切相關(guān)，因此腫瘤干細(xì)胞是腫瘤治療的關(guān)鍵靶標(biāo)?；诖嗽O(shè)計(jì)能夠靶向殺傷腫瘤干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)方案，從而對(duì)腫瘤組織起到根本性的清除作用[8]。
　　 細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic Lymphocyte，CTLs)，主要通過(guò)釋放穿孔素和顆粒酶來(lái)

3、殺傷靶細(xì)胞，并能通過(guò)Fas配體介導(dǎo)靶細(xì)胞的凋亡。其殺傷具有特異性、連續(xù)性、高效性，是機(jī)體免疫系統(tǒng)清除病毒和腫瘤細(xì)胞最主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞[9]。
　　 樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cells，DCs)是體內(nèi)已知最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞，在機(jī)體腫瘤免疫反應(yīng)中發(fā)揮巨大作用，DCs能夠直接將初始T細(xì)胞誘導(dǎo)成細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞(Cytotoxic Lymphocyte，CTLs)，誘導(dǎo)特異性的免疫應(yīng)答反應(yīng)，從而對(duì)腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生靶向殺傷作用。以

4、樹突細(xì)胞作為治療腫瘤的生物疫苗近年來(lái)成為腫瘤免疫治療的研究熱點(diǎn)之一[10]，相關(guān)的臨床應(yīng)用數(shù)據(jù)也顯示出DCs作為腫瘤疫苗有良好的治療前景，可以在一定程度上改善腫瘤患者預(yù)后，提高生存率[11-2]。
　　 本課題在常規(guī)采用腫瘤細(xì)胞總RNA誘導(dǎo)成熟DCs的基礎(chǔ)上，利用5型腺病毒Ad5作為載體將P53和TERT基因同時(shí)導(dǎo)入DCs細(xì)胞中，然后將成熟的DCs加入到初始T細(xì)胞中誘導(dǎo)其成為CTLs，在體外篩選和培養(yǎng)肝癌干細(xì)胞并檢測(cè)CTLs對(duì)腫

5、瘤干細(xì)胞的殺傷。結(jié)果成功誘導(dǎo)出能夠高效靶向殺傷肝癌干細(xì)胞的CTLs，表明1）DCs能夠誘導(dǎo)出針對(duì)肝癌干細(xì)胞的CTLs;2）向DCs中導(dǎo)入攜帶P53和TERT基因的病毒后能夠進(jìn)一步提高CTLs對(duì)肝癌干細(xì)胞的殺傷活性。本實(shí)驗(yàn)中所采用的腫瘤干細(xì)胞是肝癌Hep3B細(xì)胞系通過(guò)實(shí)驗(yàn)室建立的肝癌干細(xì)胞新型培養(yǎng)體系誘導(dǎo)和篩選得來(lái)。實(shí)驗(yàn)中用到的5型腺病毒載體Ad5是攜帶有ITR序列的病毒，反向末端重復(fù)序列(Inverted TerminalRepeat，

6、ITR)是腺病毒相關(guān)蛋白表達(dá)的順式作用元件，通過(guò)對(duì)照實(shí)驗(yàn)表明攜帶有ITR序列的腺病毒在DCs中能夠增強(qiáng)蛋白表達(dá)的數(shù)量并延長(zhǎng)表達(dá)時(shí)間，因此采用攜帶ITR序列的腺病毒提高P53和TERT基因在DCs中的表達(dá)，相關(guān)病毒載體來(lái)自于實(shí)驗(yàn)室病毒載體庫(kù)。
　　 本實(shí)驗(yàn)主要由以下五個(gè)部分組成:
　　 一、樹突細(xì)胞的體外誘導(dǎo)和培養(yǎng)
　　 取正常人外周血，稀釋后加入含淋巴細(xì)胞分離液的分離管中，離心后在淋巴細(xì)胞分離液面之上得到含單核細(xì)

7、胞的白膜層細(xì)胞，小心吸取白膜層細(xì)胞，清洗2-3次后用AIM-V培養(yǎng)基稀釋，加入六孔板中，37℃、5％ CO2下靜置過(guò)夜，將未貼壁的細(xì)胞收集以便分離T淋巴細(xì)胞，向貼壁的細(xì)胞中加入粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素4(IL-4)和FMS樣的酪氨酸激酶3(Flt3)配體，37℃、5％ CO2培養(yǎng)第5天加入肝癌干細(xì)胞總RNA，第6天加入病毒載體，第7天加入TNF-α刺激成熟，得到成熟的DCs，通過(guò)流式檢測(cè)DCs表型，結(jié)果表明D

8、Cs表達(dá)成熟DCs應(yīng)有的表型CD80, CD83, CD86, HLA-DR。
　　 二、攜帶P53和TERT的病毒載體的選擇
　　 采用表達(dá)綠色熒光的5型腺病毒載體對(duì)DCs進(jìn)行感染，比較攜帶ITR序列和未攜帶ITR序列的腺病毒載體感染DCs后綠色熒光蛋白在表達(dá)強(qiáng)度和表達(dá)時(shí)間上的差異，結(jié)果表明攜帶ITR序列的腺病毒載體在MOI=20時(shí)感染DCs后對(duì)蛋白基因的表達(dá)效果最好。
　　 三、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的體外誘導(dǎo)<

9、br>　　 樹突細(xì)胞誘導(dǎo)和培養(yǎng)過(guò)程中未貼壁的白膜層細(xì)胞中主要含有B淋巴細(xì)胞和T淋巴細(xì)胞，采用尼龍毛柱過(guò)濾吸附的方法，將此未貼壁的細(xì)胞加入預(yù)處理的尼龍毛柱中，由于尼龍毛對(duì)B淋巴細(xì)胞的親和力很大，當(dāng)混合細(xì)胞液通過(guò)尼龍毛柱時(shí)，B淋巴細(xì)胞被吸附，T淋巴細(xì)胞可以通過(guò)尼龍毛柱并得到收集，收集起來(lái)的T淋巴細(xì)胞可以用于CTLs的誘導(dǎo)。
　　 四、肝癌干細(xì)胞和特異性CTLs的體外誘導(dǎo)和培養(yǎng)
　　 采用實(shí)驗(yàn)室建立的新型肝癌干細(xì)胞培養(yǎng)基對(duì)肝

10、癌Hep3B細(xì)胞進(jìn)行體外誘導(dǎo)和培養(yǎng)。將獲得的T淋巴細(xì)胞和誘導(dǎo)成熟的DCs在體外進(jìn)行共培養(yǎng)，誘導(dǎo)T淋巴細(xì)胞成為CTLs。通過(guò)流式檢測(cè)IFN-γ的分泌比例和Elispot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)IFN-γ的分泌強(qiáng)度，結(jié)果表明誘導(dǎo)出的CTLs的IFN-γ分泌比例高，強(qiáng)度大，具有腫瘤細(xì)胞殺傷活性。
　　 五、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞在體外對(duì)肝癌干細(xì)胞的殺傷實(shí)驗(yàn)
　　 將兩種特異性CTLs:一種通過(guò)不攜帶病毒載體基因的DCs誘導(dǎo)產(chǎn)生;另一種通過(guò)攜帶病毒

11、載體基因的DCs誘導(dǎo)產(chǎn)生，分別和肝癌干細(xì)胞在體外進(jìn)行殺傷實(shí)驗(yàn)，采用CCK-8試劑盒通過(guò)酶標(biāo)儀檢測(cè)細(xì)胞殺傷，結(jié)果表明誘導(dǎo)出的CTLs對(duì)肝癌干細(xì)胞具有殺傷活性，且通過(guò)病毒攜帶P53和TERT基因感染DCs后再誘導(dǎo)出的CTLs，能夠進(jìn)一步提高CTLs對(duì)肝癌干細(xì)胞的殺傷。
　　 結(jié)論:本課題在體外成功建立了能高效殺傷腫瘤干細(xì)胞的CTLs，通過(guò)5型腺病毒載體攜帶P53和TERT基因感染DCs能進(jìn)一步提高DCs誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTLs對(duì)肝癌干細(xì)胞