胃癌、胃息肉患者胃內(nèi)微生物群落結(jié)構(gòu)的研究.pdf

1、研究背景:胃是消化道微生態(tài)系統(tǒng)中一個(gè)特別的區(qū)域,由于胃酸的分泌而構(gòu)成了其獨(dú)特的生態(tài)環(huán)境和特征性的微生物群落。目前利用宏基因組學(xué)原理和高通量測序分析技術(shù)開展微生物與人類健康和疾病的研究已經(jīng)起步,但是大部分研究主要基于腸道微生物展開,研究重點(diǎn)放在腸道微生物與腸道疾病和代謝性疾病的關(guān)系上,很少有學(xué)者關(guān)注消化道微生態(tài)在胃部疾病中的作用。現(xiàn)有的幾項(xiàng)基于高通量測序的胃內(nèi)菌群分析研究已證實(shí)胃內(nèi)存在復(fù)雜的菌群結(jié)構(gòu),胃內(nèi)除幽門螺桿菌(H.pylori)之

2、外還有其他大量微生物存在。但現(xiàn)有的少量研究主要針對國外人群,中國人群健康和胃部疾病狀態(tài)下的胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)特征并不清楚。胃癌的病因雖經(jīng)歷數(shù)十年的深入研究仍無明確定論,環(huán)境因素、飲食因素、H.pylori感染以及遺傳因素等參與了胃癌的發(fā)病機(jī)制。H.pylori與胃癌關(guān)系密切,但是胃內(nèi)其它菌群與胃癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系仍不清楚。胃癌等胃內(nèi)瘤形成過程中是否存在胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)改變及其變化特征我們?nèi)灾跎?。此?現(xiàn)階段對胃多發(fā)息肉的系統(tǒng)研究不多,主要集中于

3、胃息肉與癌變的關(guān)系以及H.pylori在其發(fā)生中的作用。目前研究證實(shí)結(jié)直腸癌和結(jié)腸息肉時(shí)腸道菌群存在結(jié)構(gòu)和功能的改變,但從胃腸道微生態(tài)角度出發(fā),通過微生物群落高通量測序方法分析胃癌、胃息肉狀態(tài)下的胃內(nèi)菌群構(gòu)成和多樣性特征的研究目前未見報(bào)道。
　　研究目的:采用細(xì)菌群高通量測序和生物信息學(xué)分析技術(shù)探討胃癌、胃多發(fā)息肉患者及胃黏膜正常的健康人群胃內(nèi)微生物群落構(gòu)成和多樣性特征,并進(jìn)行比對分析,尋找疾病顯著相關(guān)性胃內(nèi)菌群構(gòu)成或差異性菌種。

4、
　　材料與方法:2012年5月至2013年12月,基于中國北方漢族人群,在解放軍總醫(yī)院消化內(nèi)鏡中心初次診斷并經(jīng)病理學(xué)證實(shí)的胃癌和胃多發(fā)息肉患者,之前均未接受任何藥物、內(nèi)鏡或外科手術(shù)治療;同期納入無消化系統(tǒng)癥狀、H.pylori常規(guī)臨床檢測陰性且胃鏡檢查正常的的健康查體人員作為健康對照組。胃癌組采集癌組織、正常胃竇和胃體黏膜活檢樣本各1塊;胃多發(fā)息肉組采集息肉組織、正常胃竇和胃體黏膜活檢樣本各1塊;健康對照組采集正常胃竇和胃體黏膜

5、各1塊。利用酶法(QIAamp DNA Mini kit商業(yè)提取試劑盒)聯(lián)合機(jī)械法(磁珠反復(fù)擊打法)提取胃黏膜相關(guān)細(xì)菌群落總DNA。針對細(xì)菌16S rDNA的V4高變區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增;構(gòu)建胃癌、胃多發(fā)息肉和健康人胃內(nèi)細(xì)菌群落的小片段文庫;基于Illumina Miseq高通量測序平臺進(jìn)行雙末端測序。生物信息學(xué)處理和分析主要利用QIIME等軟件進(jìn)行操作分類單元( operational taxonomic units,OTUs)聚類、分析和物種

6、注釋;通過繪制稀釋曲線、Chao1曲線、Shannon指數(shù)和Rank abundance曲線進(jìn)行樣品復(fù)雜度分析(α多樣性);通過主坐標(biāo)分析(principal coordinate analysis,PCoA)和UPGMA(unweighted pair group method with arithmetic mean)聚類分析進(jìn)行健康人群、胃癌和胃多發(fā)息肉患者胃內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的比較分析(β多樣性),尋找疾病顯著相關(guān)性菌群或菌種。

7、r>　　結(jié)果:本研究最終納入初次診斷且在取材時(shí)未接受任何治療的胃癌和胃多發(fā)息肉患者各30例,健康對照組30例。胃癌組經(jīng)病理學(xué)證實(shí)全部為腺癌,其中非賁門癌18例,賁門癌12例,獲得鏡下正常胃竇、胃體黏膜及癌組織樣本共90例;胃多發(fā)息肉組包括20例胃底腺息肉和10例增生性息肉,獲得鏡下正常胃竇、胃體黏膜及息肉樣本共90例;健康對照組獲得鏡下正常胃竇和胃體黏膜共60例。組間在年齡、性別、地域和種族等方面無差異(P>0.05)。常規(guī)H.pylo

8、ri臨床檢測結(jié)果(+/-)提示:胃癌組18/12,胃多發(fā)息肉組4/26,健康對照組為0/30;胃內(nèi)H.pylori序列分析結(jié)果(+/-)證實(shí):胃癌組27/3,胃多發(fā)息肉組22/8,健康對照組為21/9;組間H.pylori相對豐度無顯著差異(P>0.05)?；谛蛄蟹治鲲@示各組前期H.pylori常規(guī)臨床檢測陰性的研究對象中,75％(9/12)的胃癌和69.2%(18/26)的胃息肉組患者,以及70%(21/30)的健康個(gè)體胃內(nèi)存在H.

9、pylori序列。
　　經(jīng)過對下機(jī)數(shù)據(jù)質(zhì)量控制等預(yù)處理,各組樣本數(shù)據(jù)合格,可滿足后續(xù)分析。利用稀釋曲線、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)和Rank abundance曲線等進(jìn)行各組樣本的復(fù)雜度分析,證實(shí)測序量足以覆蓋胃內(nèi)細(xì)菌種屬,各組樣品豐富度和均勻度較好。總體上看,胃內(nèi)共有來自20個(gè)菌門的200多種細(xì)菌種系型被鑒定出來,胃癌組、胃多發(fā)息肉組和健康對照組胃內(nèi)細(xì)菌群落多樣性組間存在差異。在門水平,健康人胃內(nèi)相對豐度處在前10位的細(xì)

10、菌門類依次為變形菌門、擬桿菌門、放線菌門、硬壁菌門、圓齒古細(xì)菌界、酸桿菌門、疣微菌門、藍(lán)藻菌門、硝化螺旋菌門和芽單胞菌門;相對豐度大于1%的共6種,蛋白菌門豐度高達(dá)72.4%,擬桿菌門占8.53%,放線菌門占7.23%,硬壁菌門6.34%,圓齒古細(xì)菌界占1.71%;其他菌門豐度在1%以下。胃腺癌患者胃內(nèi)相對豐度超過1%的優(yōu)勢菌門依次為變形菌門、圓齒古菌門、擬桿菌門、硬壁菌門、放線菌門、疣微菌門和酸桿菌門。胃多發(fā)息肉患者胃內(nèi)相對豐度超過1

11、%的菌門依次為變形菌門、硬壁菌門、擬桿菌門、放線菌門、酸桿菌門、圓齒古細(xì)菌界和疣微菌門。胃癌組、胃多發(fā)息肉組和健康對照組三組相對豐度最高的菌門均為變形菌門;此外,三組的胃內(nèi)細(xì)菌群落在屬水平的相對豐度也存在差異;后續(xù)正在對胃腺癌和胃多發(fā)息肉顯著相關(guān)性菌門、菌屬,甚至菌種進(jìn)行深入挖掘。
　　PCoA分析顯示健康人胃竇和胃體黏膜相關(guān)細(xì)菌群落構(gòu)成較為相似( PC2為9.6%,PC3為6.5%),基于Unifra的UPGMA方法無法對胃竇和

12、胃體黏膜菌群構(gòu)成實(shí)現(xiàn)組間聚類。胃癌組的正常胃竇、胃體及胃癌組織相關(guān)細(xì)菌群落的PCoA分析無法將癌組織相關(guān)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和鏡下正常的胃竇和胃體黏膜相關(guān)菌群有效的區(qū)分開;另外,非賁門腺癌組和賁門腺癌組間的胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)并無顯著差異(PC1為12.7%,PC2為8.1%);UPGMA方法對胃腺癌內(nèi)部不同分組間細(xì)菌群落構(gòu)成的相似性進(jìn)行聚類分析,同樣無法有效實(shí)現(xiàn)樣本間和組間聚類。但是,胃癌組和健康對照組胃內(nèi)細(xì)菌群落構(gòu)成的PCoA分析提示兩組間胃內(nèi)菌群

13、結(jié)構(gòu)存在顯著性差異(PC1貢獻(xiàn)度為33.6%, PC2貢獻(xiàn)度為6.3%);通過樣品加權(quán)的UPGMA聚類分析,同樣可以有效的將胃腺癌和健康人實(shí)現(xiàn)組間聚類。根據(jù)病理類型將胃多發(fā)息肉組分為胃底腺息肉組和增生性息肉組,兩組間PCoA分析的PC1貢獻(xiàn)度為11.1%,PC2貢獻(xiàn)度為9%,無法將增生性和胃底腺息肉患者的胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行區(qū)分;胃多發(fā)息肉患者胃息肉組織和鏡下正常的胃竇和胃體黏膜相關(guān)菌群結(jié)構(gòu)無顯著差異。但是,胃多發(fā)息肉組和健康對照組的PCo

14、A分析顯示PC1貢獻(xiàn)度為35.1%,PC2貢獻(xiàn)度為6.7%,可有效的將兩組的胃內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)區(qū)分開;樣品未加權(quán)的UPGMA聚類分析同樣可以有效的實(shí)現(xiàn)組間聚類。胃癌組和胃多發(fā)息肉組的PCoA分析(PC1貢獻(xiàn)度為18.1%,PC2貢獻(xiàn)度為5.7%)和未加權(quán)的UPGMA聚類分析均可將兩組的胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行有效區(qū)分和聚類。
　　結(jié)論:1.基于細(xì)菌高通量測序分析證實(shí)人體胃內(nèi)存在大量細(xì)菌群落,具有其獨(dú)特的菌群特征和多樣性。2.健康人胃竇和胃體

15、黏膜相關(guān)細(xì)菌群落構(gòu)成和多樣性相似;胃腺癌患者的癌組織及其正常胃竇/體黏膜相關(guān)菌群結(jié)構(gòu)相似,賁門癌和非賁門癌患者的胃內(nèi)細(xì)菌群落構(gòu)成和多樣性無顯著差異;胃多發(fā)息肉患者的息肉組織及其正常胃竇/體黏膜相關(guān)菌群結(jié)構(gòu)相似,胃底腺息肉和增生性息肉患者胃內(nèi)菌群結(jié)構(gòu)和多樣性無明顯差異;上述內(nèi)容進(jìn)一步提示胃內(nèi)細(xì)菌群落構(gòu)成可能不受解剖學(xué)和組織病理學(xué)等因素的影響。3.胃癌患者與健康人群,胃多發(fā)息肉患者和健康人群,以及胃癌和胃多發(fā)息肉患者間的胃內(nèi)細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和多