P物質(zhì)對(duì)T型鈣通道的調(diào)節(jié)以及T型鈣通道在疼痛中的作用.pdf

1、T型鈣通道是一類低電壓（-60mV）激活鈣通道，包括三個(gè)亞型:CaV3.1、CaV3.2、CaV3.3。在中樞神經(jīng)中T型鈣通道引發(fā)起搏點(diǎn)活動(dòng)和低閡值神經(jīng)沖動(dòng)。外周神經(jīng)系統(tǒng)T型鈣通道主要存在于中小直徑的DRG神經(jīng)元中，且主要是CaV3.2亞型。至今發(fā)現(xiàn)多種疾病都與T型鈣通道的功能狀態(tài)異常有關(guān)，如癲癇、疼痛、心臟病、糖尿病、高血壓和癌癥等。T型鈣通道有著重要的生理病理學(xué)意義，其分子調(diào)節(jié)機(jī)制一直是很多實(shí)驗(yàn)小組研究的熱點(diǎn)。
　　 由于缺

2、乏其特異性開(kāi)放劑與阻斷劑，T型鈣通道分子調(diào)節(jié)機(jī)制研究進(jìn)展緩慢。近幾年隨著其特異性開(kāi)放劑與阻斷劑的發(fā)現(xiàn)，對(duì)于T型鈣通道的分子機(jī)制的研究報(bào)道越來(lái)越多，并取得了很大進(jìn)展。但目前對(duì)于T型鈣通道的調(diào)節(jié)機(jī)制仍有許多未明之處。了解T型鈣通道的分子調(diào)節(jié)機(jī)制將為臨床預(yù)防與治療各種T型鈣通道功能異常所導(dǎo)致的疾病提供理論支持。
　　 疼痛目前仍然是困擾人們身心健康的一大難題，給人們的正常生活帶來(lái)諸多不便。離子通道與疼痛的關(guān)系早已成為人們研究的熱點(diǎn)。研

3、究發(fā)現(xiàn)，T型鈣通道功能異常與各種神經(jīng)性疼痛與炎性疼痛有著密切關(guān)系。但目前尚未見(jiàn)T型鈣通道功能調(diào)節(jié)劑對(duì)疼痛行為研究的報(bào)道。
　　 研究將圍繞T型鈣通道功能調(diào)節(jié)機(jī)制及其在疼痛中的作用展開(kāi)。
　　 第一部分.P物質(zhì)對(duì)T型鈣通道的調(diào)節(jié)及其分子機(jī)制的研究
　　 目的:研究P物質(zhì)對(duì)T型鈣通道的作用并尋找其調(diào)節(jié)作用的信號(hào)通路。包括:(1)研究P物質(zhì)對(duì)表達(dá)的CaV3.2通道電流的調(diào)節(jié)作用。(2)研究P物質(zhì)對(duì)DRG神經(jīng)元中T型鈣通

4、道電流的調(diào)節(jié)作用。(3)尋找介導(dǎo)P物質(zhì)對(duì)T型鈣通道作用的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)分子。
　　 方法:利用打孔全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)進(jìn)行研究。
　　 結(jié)果:
　　 (1)打孔全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1μMSP可顯著抑制表達(dá)在HEK293細(xì)胞中CaV3.2鈣電流（共表達(dá)NK-1受體），抑制率為30.2±6.8％(P＜0.05，n=13)且其抑制作用可被還原劑1mMDTT恢復(fù)至基礎(chǔ)電流的99.3±5.7％，n=12。
　　 (2)

5、全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，1μMSP可顯著抑制DRG神經(jīng)元中T型鈣電流，抑制率為25.9％±5.3％(P＜0.05，n=11)。且抑制作用可被1mMDTT恢復(fù)至基礎(chǔ)電流的105.7±11％(n=8)。SP對(duì)高電壓激活(HVA)鈣通道功能無(wú)影響。
　　 (3)H2O2(300μM)可抑制過(guò)表達(dá)系統(tǒng)中CaV3.2鈣通道電流，抑制率為9.4±1.7％(P＜0.05，n=5)。其抑制可以被DTT洗脫（電流恢復(fù)至抑制前的102.1±1.3

6、％，n=5）。但H2O2對(duì)T型鈣通道的抑制作用明顯小于SP所產(chǎn)生的抑制作用。
　　 (4)AntimycinA(1μM)灌流給藥可使表達(dá)系統(tǒng)中CaV3.2鈣電流增大到基礎(chǔ)電流的142.1±7.6％(P＜0.05，n=8)，但DTT不能使電流恢復(fù)至基礎(chǔ)電流水平。
　　 (5)SP不能抑制HEK293細(xì)胞中表達(dá)的突變體CaV3.2(H191Q)（共表達(dá)NK-1受體）電流(n=8)。
　　 結(jié)論:運(yùn)用電生理膜片鉗手段發(fā)

7、現(xiàn)SP選擇性抑制T型鈣通道電流，而對(duì)高電壓激活鈣通道無(wú)作用。
　　 這種抑制作用的信號(hào)分子可能是細(xì)胞內(nèi)的ROS，其作用關(guān)鍵位點(diǎn)位于CaV3.2的191位組氨酸。
　　 第二部分.T型鈣通道激動(dòng)劑ST101對(duì)CaV3.2電流和疼痛行為的影響
　　 目的:觀察大鼠右后腳掌注射T型鈣通道開(kāi)放劑ST101對(duì)動(dòng)物疼痛行為的影響。具體研究(1)T型鈣通道開(kāi)放劑ST101對(duì)表達(dá)的CaV3.2鈣電流的作用，并根據(jù)EC50確定動(dòng)物

8、痛實(shí)驗(yàn)中所用藥物濃度。(2)ST101在自發(fā)性疼痛、熱痛和機(jī)械刺痛中的作用。
　　 方法:全細(xì)胞膜片鉗技術(shù);大鼠自發(fā)性疼痛、熱痛和機(jī)械刺痛模型。
　　 結(jié)果:
　　 (1)ST101可以增大過(guò)表達(dá)于HEK293細(xì)胞中的CaV3.2鈣電流，其作用呈濃度依賴性，EC50為8.7±1.4nM。100nM的ST101到達(dá)最大效應(yīng)，可使CaV3.2鈣電流增大42.4±4.2％(n=5)。
　　 (2)整體動(dòng)物行為學(xué)

9、實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，足掌部注射ST101不能引起大鼠腳掌自發(fā)性疼痛，動(dòng)物舔、抬、啃腳的總時(shí)間分別為:溶劑(saline)(25μl)，5.9±1.7s;ST101(20μM,25μl),15.3±5.1s;緩激肽(BK)(200μM,25μl)100.3±17.9s(P=0.09,n=13)。
　　 (3)在熱痛與機(jī)械刺痛實(shí)驗(yàn)中，足掌部注射相同量的ST101也不能使動(dòng)物腳掌痛覺(jué)增敏。機(jī)械刺痛閾分別為:ST101組給藥前為68.4±7.

10、9g，給藥后為59.3±4.8g(P＞0.05，n=5);對(duì)照組（saline組）給藥前為60±0g，給藥后為53.2±6.8g(P＞0.05，n=5)。熱痛實(shí)驗(yàn)結(jié)果為:ST101組給藥前為36.3±3.2s，給藥后為38.6±2.0s(P＞0.05，n=5);對(duì)照組（saline組）給藥前為38.9±0.9s，給藥后為38.6±0.6s(P＞0.05，n=5)。
　　 結(jié)論:本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ST101可增大過(guò)表達(dá)系統(tǒng)中的C