姜黃素衍生物C213抑制線粒體Hsp90功能及抗白血病的作用.pdf

1、目的：研究姜黃素衍生物C213干擾線粒體Hsp90功能和抗白血病作用。
　　方法：
　　1.利用四甲基偶氮唑藍(MTT）法檢測 C213對 K562、HL60、MCF-7、SMMC-7721、HT-29、SW620、CNE2、SGC7901和KB等腫瘤細胞的增殖抑制作用。
　　2.通過western blot法和免疫共沉淀法對比C213與姜黃素Cur對熱休克相關(guān)蛋白和Hsp90客戶蛋白表達量的影響，來考察C213對白血

2、病細胞中Hsp90分子伴侶功能的影響。
　　3.采用JC-1染色K562和HL60細胞，應用流式細胞儀來檢測C213對白血病細胞線粒體膜電位影響；采用western blot方法，考察C213對K562和HL60細胞Caspase凋亡途徑的影響；采用Annexin V/FITC凋亡試劑盒，應用流式細胞儀檢測C213對K562和HL60細胞狀態(tài)分布的影響。
　　4.應用線粒體蛋白提取試劑盒，提取K562和HL60細胞的線粒體蛋

3、白，用各細胞器的標志蛋白檢測線粒體蛋白的純度；應用免疫共沉淀法，以 CypD抑制劑環(huán)孢菌素CsA和經(jīng)典的胞漿Hsp90抑制劑為對照，考察C213對線粒體蛋白中Hsp90-CypD復合物的影響。
　　5.采用Western blot法檢測C213對K562和HL60細胞周期蛋白因子的影響；通過PI染色，用流式細胞儀檢測C213對白血病細胞周期分布的影響。
　　結(jié)果：
　　1.姜黃素衍生物C213在體外能抑制K562、HL

4、60、MCF-7、SMMC-7721、HT-29、SW620、CNE2、SGC7901和KB等細胞的增殖，C213處理腫瘤細胞48小時后，MTT法測得IC50值在1-10μM之間，對白血病K562和HL60的效果最好，分別為1.01和0.87μM。
　　2.用K562腫瘤細胞裂解液，對Hsp90進行免疫共沉淀，與對照組相比，可引起與Hsp90結(jié)合的客戶蛋白Akt和P210Bcr-abl的含量下降。通過C213（0.5,1,2μM）

5、和Cur（2.5,5,10μM）分別處理K562細胞24h后，免疫印記顯示細胞中的Hsp70的含量上升， Hsp90、p23和p60HOP的蛋白含量無明顯變化，同時細胞中的Hsp90客戶蛋白Bcr-Ab l、Akt的表達下降，并且呈劑量依賴關(guān)系。根據(jù)實驗結(jié)果推測C213對Hsp90分子伴侶功能抑制的作用與C ur相似，并且活性要強于Cur。MG132是一個常用的蛋白酶體抑制劑，可以逆轉(zhuǎn)由蛋白酶體途徑引起的蛋白的降解，用C213作用于K5

6、622h后，再加入MG132共同孵育2h。從免疫印跡的結(jié)果分析，MG132可以完全阻斷由C213引起的Hsp90客戶蛋白的降解。
　　3.0、0.5、1、2μMC213處理K562細胞發(fā)生線粒體膜電位變化的比例為：14.0％、21.6%、37.0%、43.7%，相同濃度的C213處理HL60細胞發(fā)生線粒體膜變化的比例為：14.3%、22.5%、42.4%、51.7%；2μMC213處理K562細胞0、15、30、60min后，發(fā)生

7、線粒體膜變化的比例為：17.0%、21.8%、30.3%、39.7%，相同濃度的C213處理HL60細胞發(fā)生線粒體膜變化的比例為：15.7%、19.3%、31.5%、40.2%；0、0.5、1、2μMC213作用于K562和HL60細胞后，Caspase3和9及ParP下調(diào)，其裂解片段表達量上升，抗凋亡因子Bc l-2下調(diào)， CytC表達量上升；C213作用于K562和HL60細胞24h，隨著藥物濃度的增大，早期凋亡的細胞所占的比例越來

8、越大。
　　4.用各細胞器的標志蛋白western blot檢測證明提取的線粒體蛋白基本上可以排除其他細胞器中蛋白的干擾。對 HL60和 K562的線粒體蛋白進行 Hsp90免疫共沉淀，C213均可以顯著地降低與Hsp90相結(jié)合的CypD，而Cyp D抑制劑環(huán)孢菌素 CsA和經(jīng)典的胞漿 Hsp90抑制劑均不能干擾線粒體內(nèi)的Hsp90-CypD復合物結(jié)合。
　　5. C213濃度的增大，細胞周期蛋白 CDK4和 CDK6沒有明

9、顯的變化， Cdc2表達量下降，p21的表達量上調(diào)；由流式細胞儀測得，C213處理24h的白血病細胞K562和HL60表現(xiàn)出明顯的G2/M期阻滯。
　　結(jié)論：
　　1.姜黃素衍生物C213對多種腫瘤細胞的惡性增殖具有明顯的抑制作用。
　　2. C213能夠干擾Hsp90分子伴侶功能，對熱休克蛋白及 Hsp90客戶蛋白的影響效果與Cur相似。
　　3. C213能夠誘導白血病細胞K562和HL60進行線粒體凋亡，導