菜青蟲酚氧化酶抑制劑的抑制動(dòng)力學(xué)及其構(gòu)效關(guān)系（QSAR）研究.pdf

1、酚氧化酶 (Phenoloxidase，PO) (EC.1.14.18.1)又稱酪氨酸酶 (Tyrosinase)，是結(jié)構(gòu)復(fù)雜的多亞基的含銅氧化還原酶。它廣泛存在于動(dòng)物、植物和微生物等生物體內(nèi)，與人體的衰老、傷口愈合、果蔬的褐變等有密切關(guān)系。它是昆蟲體內(nèi)的一種重要酶類，在昆蟲的變態(tài)發(fā)育和免疫系統(tǒng)中起著重要作用。由于酚氧化酶具有重要的理論意義和發(fā)展前景，大量的研究工作集中在此領(lǐng)域，篩選、設(shè)計(jì)、合成酚氧化酶抑制劑成為研究熱點(diǎn)。 在前

2、期研究的基礎(chǔ)上，本文以菜青蟲 (Pieris rapae L.) 酚氧化酶為試驗(yàn)對(duì)象，測(cè)定了5，7，4’-三羥基黃酮等化合物對(duì)菜青蟲幼蟲生長發(fā)育的影響；選取銅鐵試劑等化合物為酶抑制劑，研究它們對(duì)酚氧化酶的抑制作用；采用我們課題組自主設(shè)計(jì)、合成的 3-羥基-4-甲氧基苯甲醛縮氨基硫脲等化合物為效應(yīng)物，研究了它們對(duì)菜青蟲酚氧化酶的抑制動(dòng)力學(xué)，并建立了抑制作用模型；根據(jù)測(cè)得的抑制活性結(jié)果，進(jìn)行了定量的結(jié)構(gòu)與活性關(guān)系的研究，獲得了具有較強(qiáng)預(yù)測(cè)能

3、力的構(gòu)效關(guān)系模型；應(yīng)用FlexX法將抑制劑小分子與酚氧化酶活性位點(diǎn)成功進(jìn)行了分子對(duì)接。本文的主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下。 1．選用5，7，4’-三羥基黃酮、槲皮素、蘆丁、5-甲氧基水楊酸和曲酸五種化合物，采用觸殺和攝食毒力法進(jìn)行了生物活性測(cè)定，研究生物源化合物對(duì)菜青蟲幼蟲生長發(fā)育的影響，結(jié)果表明，5，7，4’-三羥基黃酮和槲皮素對(duì)菜青蟲幼蟲生長發(fā)育具有明顯的影響，浸漬法處理后72 h，兩種化合物對(duì)試蟲致死LC<,50>值分別為0.2

4、26和0.951 g/L；葉片藥膜法處理后72 h，LC<,50>值分別為0.062和2.420g/L。采用葉片藥膜法時(shí)，當(dāng)5，7，4’-三羥基黃酮的濃度高于 0.200 g/L時(shí)，所有試蟲均不能正?；?；采用浸漬法時(shí)，與對(duì)照相比，用5，7，4’-三羥基黃酮、槲皮素、蘆丁、5-甲氧基水楊酸和曲酸處理的試蟲5齡幼蟲體重增長量明顯降低。 2．對(duì)菜青蟲酚氧化酶進(jìn)行初步分離純化，并研究了基本酶學(xué)特性。研究結(jié)果表明：酶活力存在于35％飽和

5、度硫酸銨的沉淀中，得率為 69.52％，再經(jīng)Sephadex G-100凝膠過濾層析進(jìn)一步純化，測(cè)得比活力為粗酶的6.22倍，得率為42.50％。研究部分純化的菜青蟲酚氧化酶的基本特性得出，該酶的最適pH值為7.0，pH在6.5～7.4范圍內(nèi)酶保持穩(wěn)定的活力。最適溫度為42℃，當(dāng)溫度低于32℃時(shí)，酶具有穩(wěn)定的活力。研究金屬離子對(duì)酶活力的影響，結(jié)果表明Na<'+>和K<'+>對(duì)酶活力沒有影響：Cu<'2+>在0～0.100 mmol/L

6、范圍內(nèi)對(duì)酶活力表現(xiàn)激活作用，濃度大于0.125 mmol/L 時(shí)表現(xiàn)抑制作用，其IC<,50>為0.651 mmol/L。 3．測(cè)定了4-己基間苯二酚、4-十二烷基間苯二酚、銅鐵試劑、5，7，4’-三羥基黃酮和槲皮素對(duì)酶活力的抑制作用，并探討了其抑制機(jī)理。研究結(jié)果表明：4-己基間苯二酚和4-十二烷基間苯二酚對(duì)酶表現(xiàn)可逆抑制效應(yīng)，均為競(jìng)爭(zhēng)型抑制類型，其IC<,50>分別為1.50 μmol/L 和1.12μmol/L，抑制常數(shù)K

7、<,>分別為0.50 μmol/L，和0.47 μmol/L；銅鐵試劑對(duì)酶表現(xiàn)為可逆抑制效應(yīng)，為競(jìng)爭(zhēng)型抑制類型，其IC<,50>為0.10 mmol/L，K<,I>為0.076 mmol/L；5，7，4’-三羥基黃酮和槲皮素對(duì)菜青蟲酚氧化酶具有明顯的抑制作用， IC<,50>分別為25.65 mg/L 和43.94 mg/L；研究不同濃度銅離子對(duì)該酶的影響，結(jié)果表明Cu<'2+>在0～0.100 mmol/L 范圍內(nèi)對(duì)酶活力表現(xiàn)激活作用

8、，濃度大于0.125 mmol/L 時(shí)表現(xiàn)抑制作用，其IC<,50>為0.651 mmol/L。 4．以L-酪氨酸和L-DOPA為底物，在氧飽和的條件下測(cè)定酚氧化酶氧化底物的動(dòng)力學(xué)過程：測(cè)定抑制劑3-羥基-4-甲氧基苯甲醛縮氨基硫脲 (3-H-4-MBT)和2-羥基苯甲醛(2-HBD)對(duì)酚氧化酶單酚酶和二酚酶活性的影響，研究結(jié)果表明：3-H-4-MBT和2-HBD均能顯著抑制單酚酶和二酚酶活性，在酶的測(cè)活體系中加入3-H-4-M

9、BT或2-HBD，二者均能顯著延長反應(yīng)體系到達(dá)穩(wěn)態(tài)的時(shí)間，即這兩種化合物均可延長酶反應(yīng)的遲滯時(shí)間。研究結(jié)果顯示3-H-4-MBT和2-HBD均為可逆的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，3-H-4-MBT 對(duì)單酚酶和二酚酶的IC<,50>分別為0.14±0.02 μmol/L 和0.26±0.04 μmol/L，對(duì)二酚酶的抑制常數(shù)K<,I>(K<,I>=K<,IS>)為0.30μmol/L；2-HBD對(duì)單酚酶和二酚酶的IC<,50>分別為8.08±0.11

10、 mmol/L 和4.14±0.08mmol/L，對(duì)二酚酶的抑制常數(shù) K<,I>(K<,I>=K<,IS>)為 1.21 mmol/L。在不同濃度的3-H-4-MBT(或2-HBD)測(cè)活體系中，測(cè)定酚氧化酶氧化底物L(fēng)-DOPA的動(dòng)力學(xué)過程，隨著反應(yīng)時(shí)間的增加，反應(yīng)體系逐漸到達(dá)穩(wěn)態(tài)，此時(shí)反應(yīng)歷程為一直線。根據(jù)鄒氏動(dòng)力學(xué)原理，建立了3-H-4-MBT (2-HBD)對(duì)酚氧化酶的抑制模型，并求得抑制反應(yīng)速率常數(shù)k<,-0> 和k<,+0>。

11、 5．定量構(gòu)效關(guān)系(QSAR)是農(nóng)藥分子設(shè)計(jì)中很重要的方法，本文詳細(xì)介紹了2D-QSAR中的Hansch-Fujita法及3D-QSAR中的比較分子力場(chǎng)分析(CoMFA)法和比較分子相似指數(shù)分析(CoMSIA)法，并運(yùn)用上述三種方法對(duì)酚氧化酶抑制劑進(jìn)行了構(gòu)效關(guān)系研究。 運(yùn)用 Hansch-Fujita 法對(duì)苯甲醛類、苯甲酸類和苯甲醛縮氨基硫脲類三組化合物進(jìn)行了2D-QSAR研究，其中采用了Hammett電子效應(yīng)參數(shù)σ、疏水

12、性參數(shù)clogP、立體效應(yīng)參數(shù)MR和氫鍵受體共四個(gè)參數(shù)，研究結(jié)果表明，苯甲酸類和苯甲醛縮氨基硫脲類兩組化合物的構(gòu)效關(guān)系特點(diǎn)比較相似，這也說明此兩類化合物很可能作用在酶的同一位點(diǎn)，并且氫鍵受體和立體效應(yīng)參數(shù)是影響化合物抑制活性的兩大因子；而苯甲醛類化合物的構(gòu)效關(guān)系不同于上述兩組化合物，影響該組化合物生物活性的因子主要是疏水性參數(shù)clogP。 應(yīng)用CoMFA和CoMSIA兩種方法，采用公共亞結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)的疊合原則，進(jìn)行了三維定量構(gòu)效關(guān)系

13、(3D-QSAR)研究，研究結(jié)果表明，構(gòu)建的CoMFA和CoMSIA模型具有很好的預(yù)測(cè)能力，統(tǒng)計(jì)結(jié)果可靠。CoMFA模型中使用了6個(gè)主成分，模型的交叉驗(yàn)證系數(shù)q<'2>=0.926，預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)誤(SEE)為0.250，非交叉驗(yàn)證系數(shù)r<'2>=0.986。CoMSIA模型的建立采用了立體場(chǎng)(steric)、靜電場(chǎng)(electrostatic)、疏水場(chǎng)(hydrophobic)、氫鍵受體場(chǎng)(hydrogen bond acceptor)和氫

14、鍵供體場(chǎng)(hydrogen bond donor)五種場(chǎng)的自由組合。當(dāng)模型采用立體場(chǎng)、疏水場(chǎng)和氫鍵受體場(chǎng)三個(gè)場(chǎng)時(shí)，模型的交叉驗(yàn)證系數(shù)q<'2>=0.933，非交叉驗(yàn)證系數(shù)r<'2>=0.984，F(xiàn)值和SEE值分別為381.764和0.271。因此，獲得的3D-QSAR模型將為設(shè)計(jì)新穎、高活性的酚氧化酶抑制劑提供理論指導(dǎo)。 6．本文采用FlexX法，以抑制劑小分子為配體，以抗生鏈酶菌(S.Castaneoglobisporus)酚

15、氧化酶晶體(PDB：1WX2)為受體進(jìn)行了分子對(duì)接。研究結(jié)果表明：用FlexX法將抑制劑小分子成功對(duì)接到酶的活性中心，抑制劑在酶活性位點(diǎn)的結(jié)合方式有三種，第一種結(jié)合方式是苯甲醛縮氨基硫脲類化合物與酶活性位點(diǎn)的結(jié)合，其主要結(jié)合模式為化合物上縮氨基硫脲結(jié)構(gòu)中的“夾鉗”(H<'21>-N<'9>-C<'10>-N<'12>-H<'22>)結(jié)構(gòu)與酪氨酸殘基(Tyr<'98>)上的氧原子形成氫鍵；第二種結(jié)合方式是苯甲醛類化合物與酚氧化酶活性位點(diǎn)的