茉莉酸輔助的煙草煙堿突變體篩選及分子生理學(xué)研究.pdf

1、煙草是我國(guó)種植面積最廣的經(jīng)濟(jì)作物之一，在國(guó)民經(jīng)濟(jì)與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中具有重要地位。煙葉質(zhì)量是煙草經(jīng)濟(jì)價(jià)值的直接體現(xiàn)。其中，煙堿是衡量煙葉化學(xué)品質(zhì)的重要指標(biāo)，也是影響人們健康的關(guān)鍵因素，適堿少害煙草一直是煙草產(chǎn)業(yè)的發(fā)展方向。生產(chǎn)上，傳統(tǒng)家系選擇法和雜交育種法具有育種周期長(zhǎng)、工作量大及優(yōu)良性狀遺傳不穩(wěn)定等缺點(diǎn)，在生物技術(shù)快速發(fā)展的今天，有必要利用分子生物學(xué)技術(shù)手段，通過(guò)篩選煙草煙堿突變體揭示其分子機(jī)理，為煙草低堿品種選育與栽培實(shí)踐提供理論支撐和生產(chǎn)

2、參考。茉莉素信號(hào)途徑參與煙堿合成代謝和植物抗病調(diào)控，茉莉酸可以影響種子萌發(fā)和根發(fā)育。本研究主要內(nèi)容包括：
　　⑴茉莉酸輔助篩選煙草煙堿激活標(biāo)簽突變體。開(kāi)發(fā)了一種高通量篩選煙草激活標(biāo)簽突變體庫(kù)的新方法：茉莉酸敏感性輔助篩選煙堿突變體。首先，在茉莉酸選擇壓力下篩選萌發(fā)時(shí)間和根長(zhǎng)與對(duì)照存在差異的突變體；其次，以這些突變體為材料，通過(guò)測(cè)定打頂前后煙堿含量篩選煙堿突變體；然后，進(jìn)一步篩選在三代內(nèi)保持穩(wěn)定的茉莉酸敏感性和煙堿含量的的突變體。這

3、個(gè)突變體篩選方法簡(jiǎn)單高效、省財(cái)省力，同時(shí)具有挖掘茉莉酸介導(dǎo)的煙堿合成新基因的潛能。在3000份T1代煙草激活標(biāo)簽突變體庫(kù)中篩出48個(gè)萌發(fā)時(shí)間和根長(zhǎng)具有異常的茉莉酸敏感性的突變體。進(jìn)一步篩選后一共找到8個(gè)煙堿含量異常的突變體，它們?cè)?代內(nèi)保持穩(wěn)定的茉莉酸敏感性和煙堿含量。這些突變體可以分為兩類，第一類的5個(gè)突變體在打頂前后具有相同級(jí)別的煙堿含量，分別命名為nit3、nit6、nit7、nit9和nit10。其中nit3和nit6為偏低煙堿

4、突變體，對(duì)茉莉酸低敏感；nit7為偏高煙堿突變體，對(duì)茉莉酸敏感；nit9和nit10為高煙堿突變體，對(duì)茉莉酸高敏感。第二類的3個(gè)突變體在打頂前后具有不同級(jí)別的煙堿含量，我們將其稱為特殊煙堿突變體，分別命名為nit11、nit14、nit17，其中nit11的煙堿含量在打頂前偏低打頂后偏高，對(duì)茉莉酸不敏感；nit14的煙堿含量在打頂前偏低打頂后高，對(duì)茉莉酸低敏感；nit17的煙堿含量在打頂前高打頂后偏低，對(duì)茉莉酸高敏感。
　　⑵突變

5、體的生理特性。以第一類的5個(gè)煙堿突變體和第二類的3個(gè)特殊煙堿突變體為材料，測(cè)定了茉莉酸甲酯（MeJA）處理及打頂前和處理1天、14天、28天的碳氮代謝酶（INV、GS）活性。同時(shí)測(cè)定了處理前與MeJA處理及打頂28天的總氮含量、可溶性糖含量，內(nèi)源激素含量（ABA、IAA、GA、ZR）和光合指標(biāo)（葉綠素含量、凈光合速率、胞間CO2濃度、氣孔導(dǎo)度）。第一類5個(gè)煙堿突變體的煙堿含量與INV、GS活性負(fù)相關(guān)，與總氮含量正相關(guān)；MeJA處理和打頂

6、能明顯降低煙草的GS活性，煙堿含量越高，MeJA處理和打頂對(duì)總氮含量的提高越明顯；煙堿含量與植物激素ABA正相關(guān)，與IAA和GA負(fù)相關(guān)，MeJA處理和打頂可以明顯降低突變體IAA和GA含量；煙堿含量與葉綠素含量、凈光合速率、胞間CO2濃度負(fù)相關(guān)，與氣孔導(dǎo)度正相關(guān)，煙堿含量越高，MeJA處理和打頂對(duì)氣孔導(dǎo)度的提高越明顯。第二類3個(gè)特殊煙堿突變體煙堿含量在打頂前后變化異常，其生理特性與第一類5個(gè)煙堿突變體存在差異，nit11煙堿含量在打頂后

7、大幅增加，可能與可溶性糖含量上升、與ABA含量增加以及葉綠素含量和凈光合速率下降有關(guān)。nit14的煙堿含量在打頂后大幅增加可能與GA含量增加和氣孔導(dǎo)度升高有關(guān)。nit17的煙堿在打頂后降低可能與總氮含量增加、可溶性糖含量下降、IAA和GA含量下降以及葉綠素含量、凈光合速率和氣孔導(dǎo)度升高有關(guān)。
　　⑶突變體分子特性。對(duì)突變體進(jìn)行Bar基因檢測(cè)，結(jié)果表明8個(gè)突變體均含有pSKI015激活標(biāo)簽；Southern雜交結(jié)果表明煙堿突變體ni

8、t6、nit9有兩個(gè)T-DNA插入基因組中，nit3、nit7和nit10各有一個(gè)T-DNA插入基因組中；特殊煙堿突變體nit11有兩個(gè)T-DNA插入基因組中，nit14和nit17各有一個(gè)T-DNA插入基因組中。突變體的茉莉酸敏感性和NtMYC2的表達(dá)水平高度一致。第一類5個(gè)煙堿突變體中煙堿合成基因的表達(dá)水平受JA的影響，且與JA誘導(dǎo)煙堿合成的作用機(jī)理相吻合；第二類3個(gè)特殊煙堿突變體中煙堿合成基因的表達(dá)水平受JA的影響，但每個(gè)突變體具

9、有不同的基因表達(dá)模式，MeJA處理前，nit11的NtBBL基因表達(dá)量低于對(duì)照HD，MeJA處理后，NtBBL基因表達(dá)量明顯升高，NtPMT基因表達(dá)量明顯低于對(duì)照。nit14的NtODC基因表達(dá)量在MeJA處理前后均低于對(duì)照HD；NtA622基因的表達(dá)量在MeJA處理前后均明顯高于對(duì)照；NtPMT基因在MeJA處理前表達(dá)量高，MeJA處理后表達(dá)量明顯降低，NtBBL基因在MeJA處理后不被誘導(dǎo)，NtNUP1基因在MeJA處理后表達(dá)量大幅

10、增加。nit17的大部分煙堿合成基因表達(dá)量與對(duì)照無(wú)顯著差異，而煙堿轉(zhuǎn)運(yùn)基因NtNUP1的表達(dá)量在MeJA處理前后均明顯低于對(duì)照。
　?、韧蛔凅w側(cè)翼序列獲得及候選基因預(yù)測(cè)。以第一類5個(gè)煙堿突變體和第二類3個(gè)特殊煙堿突變體的T4代為材料，用FPNI-PCR、TAIL-PCR、單引物PCR、IPCR和質(zhì)粒拯救共5種方法擴(kuò)增突變體側(cè)翼序列，經(jīng)比較可知，優(yōu)化后的FPNI-PCR法擴(kuò)增側(cè)翼序列效果最好，可以作為煙草激活標(biāo)簽T-DNA側(cè)翼序列擴(kuò)

11、增的首選方法。最終獲得10條不同的側(cè)翼序列，與煙草基因組數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)后特殊煙堿突變體nit11、nit14和nit17的側(cè)翼序列可以找到同源蛋白，其中nit11找到2個(gè)插入位點(diǎn)附近基因，在煙草基因組中的命名分別為Ntab0396680和Ntab0396670。nit14找到2個(gè)插入位點(diǎn)附近基因，在煙草基因組中的命名分別為Ntab0583900和Ntab0583910。nit17找到4個(gè)插入位點(diǎn)附近基因，在煙草基因組中的命名分別為Ntab0

12、555610、Ntab0555600、Ntab0555620、Ntab0555630。經(jīng)基因表達(dá)量分析后nit11、nit14和nit17各確定了一個(gè)候選基因，nit11的候選基因編號(hào)為D1-2，對(duì)應(yīng)的煙草基因名稱為Ntab0396670；nit14的候選基因編號(hào)為D4-1，對(duì)應(yīng)的煙草基因名稱為Ntab0583900；nit17的候選基因編號(hào)為D7-1，對(duì)應(yīng)的煙草基因名稱為Ntab0555610。對(duì)3個(gè)突變體的候選基因進(jìn)行茉莉酸應(yīng)答分析

13、，其中nit17的候選基因Ntab0555610（D7-1）在MeJA處理后少量增加。
　　⑸nit17的候選基因分析。為了驗(yàn)證nit17的突變表型是由T-DNA插入引起，我們對(duì)nit17的10個(gè)T2代分離株系進(jìn)行共分離鑒定，結(jié)果表明nit17的突變是由T-DNA插入引起，突變表型在后代發(fā)生了分離，在同一株系有突變表型的植株存在雜合基因型，說(shuō)明該突變是T-DNA單基因控制的顯性突變。特殊煙堿突變體nit17的候選基因Ntab055

14、5610與多向耐藥性轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白PDR1同源，我們將其命名為NtPDR30。構(gòu)建帶有eGFP的NtPDR30基因過(guò)表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系，在接種煙草白粉病后轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株和nit17均具有抗病性。對(duì)NtPDR30蛋白進(jìn)行了不同物種間的同源性比較、蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)和亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)NtPDR30蛋白與其它物種PDR蛋白具有較高的同源性，NtPDR30蛋白具有ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白家族特有的NBD-TMD-NBD-TMD結(jié)構(gòu)，并在植物細(xì)胞膜上表達(dá)。分析了茉莉酸