可注射細(xì)胞微球明膠復(fù)合物聯(lián)合血小板裂解液在牙組織工程中的應(yīng)用研究.pdf

1、口腔臨床治療過程中，觀察視野及手術(shù)入路狹小，同時(shí)齲洞、根管等臨床常規(guī)治療部位的解剖形態(tài)復(fù)雜多變，操作時(shí)間亦受到限制。上述臨床實(shí)際均限制了體外預(yù)成型類生物支架材料的應(yīng)用，不利于組織工程技術(shù)在口腔臨床治療領(lǐng)域的普及。而可注射性支架材料因具有一定流動(dòng)性，故可通過簡(jiǎn)便、微創(chuàng)的注射方式將搭載的細(xì)胞或生物活性物質(zhì)遞送至特定部位，并在體內(nèi)固化成形以貼合適應(yīng)不規(guī)則缺損。本課題組成員前期分別構(gòu)建了兩種可注射性的生物材料：納米纖維微球載體（nanofibr

2、ous microspheres，NF-MS）及明膠支架（Gelatin）。NF-MS已被前期研究證實(shí)，相較于傳統(tǒng)的實(shí)心微球載體（solid-interior microspheres，SI-MS），在促進(jìn)軟骨細(xì)胞黏附、增殖及軟骨組織再生等方面具有更為理想的生物學(xué)效應(yīng)；而Gelatin具有體內(nèi)交聯(lián)固化成形的水凝膠特征，能夠在包被細(xì)胞或生物活性物質(zhì)的基礎(chǔ)上，維持一定時(shí)間內(nèi)細(xì)胞等有效包被成分在特定部位的聚集。本研究擬基于上述兩種可注射性支架

3、材料，嘗試構(gòu)建復(fù)合運(yùn)用兩者的新模式；并以牙髓干細(xì)胞（dental pulp stem cells，DPSCs）為種子細(xì)胞，同時(shí)引入血小板裂解液（platelet lysate，PL）作為生長(zhǎng)因子來(lái)源；綜合上述要素，針對(duì)此模式應(yīng)用于體內(nèi)牙髓牙本質(zhì)再生的可行性，進(jìn)行前期基礎(chǔ)性研究，以期為后續(xù)的相關(guān)研究及臨床應(yīng)用提供新的思路及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。本研究主要結(jié)果及結(jié)論如下：
　　1．DPSCs復(fù)合微球載體培養(yǎng)模式下，相較于SI-MS，NF-MS能夠

4、顯著促進(jìn)DPSCs的體外黏附、增殖及礦化；而培養(yǎng)環(huán)境中PL的引入在協(xié)同擴(kuò)大NF-MS上述優(yōu)勢(shì)的同時(shí)，也使得培養(yǎng)中后期生長(zhǎng)于SI-MS上的DPSCs的上述活力顯著高于同期NF-MS上未受PL刺激的DPSCs，表明PL在一定程度上彌補(bǔ)了SI-MS的原有劣勢(shì)。細(xì)胞/微球復(fù)合物經(jīng)過體外7天的礦化預(yù)刺激后，注射于裸鼠皮下8周，取材觀察結(jié)果顯示 NF-MS/PL組移植物內(nèi)可觀察到牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體樣結(jié)構(gòu)的形成，且新生組織的量及鈣含量均顯著優(yōu)于其他組，

5、而NF-MS組與SI-MS/PL組間各定量指標(biāo)無(wú)顯著性差異，SI-MS組體內(nèi)組織新生能力相對(duì)弱于上述三組。上述結(jié)果表明DPSCs復(fù)合微球載體培養(yǎng)時(shí)，結(jié)合NF-MS與PL兩者的優(yōu)勢(shì)，可以顯著促進(jìn)細(xì)胞/微球復(fù)合物體外、體內(nèi)的成牙能力。
　　2．DPSCs復(fù)合Gelatin培養(yǎng)模式下，Gelatin對(duì)DPSCs的生長(zhǎng)具有良好的支持效應(yīng)；同期包被入Gelatin水凝膠的PL在細(xì)胞/明膠復(fù)合物5天的體外培養(yǎng)周期內(nèi)，能夠顯著促進(jìn)復(fù)合物內(nèi) DP

6、SCs的增殖；而細(xì)胞/明膠復(fù)合物注射入裸鼠皮下8周后，Gelatin組及 Gelatin/PL組移植物內(nèi)均未形成具有特征性結(jié)構(gòu)的硬組織，僅可觀察到散在的鈣化組織。上述結(jié)果表明，雖然Gelatin能夠基于其內(nèi)包被的諸如PL等營(yíng)養(yǎng)或活性物質(zhì)在一定時(shí)間內(nèi)支持、促進(jìn)DPSCs的體內(nèi)外活性，但其單獨(dú)使用時(shí)并無(wú)顯著支持DPSCs體內(nèi)形成特征性硬組織、尤其是牙原性組織的材料屬性，因而在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中需要與前述的微球載體復(fù)合應(yīng)用加以觀察比較。
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7、．細(xì)胞/微球/明膠復(fù)合培養(yǎng)模式下，采用分階段復(fù)合方式構(gòu)建細(xì)胞/微球/明膠復(fù)合物：DPSCs與微球載體于體外先期復(fù)合培養(yǎng)，期間以含有PL的條件培養(yǎng)基對(duì)細(xì)胞/微球復(fù)合物進(jìn)行預(yù)刺激，以調(diào)整細(xì)胞至理想生長(zhǎng)狀態(tài)；隨后細(xì)胞/微球復(fù)合物經(jīng)由Gelatin包被，形成細(xì)胞/微球/明膠復(fù)合物用于體內(nèi)、外觀察。結(jié)果顯示：體外培養(yǎng)環(huán)境中，Gelatin內(nèi)包被的PL在5天的培養(yǎng)周期內(nèi)維持了NF-MS結(jié)合PL獲得的細(xì)胞先期生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞/微球

8、/明膠培養(yǎng)階段 DPSCs的體外增殖活力；裸鼠體內(nèi)移植8周后NF-MS/Gelatin組及NF-MS/Gelatin-PL組均形成了牙髓牙本質(zhì)復(fù)合體樣組織，而SI-MS/Gelatin組及SI-MS/Gelatin-PL組僅形成了骨樣組織，相同微球載體組間的樣本鈣含量無(wú)顯著性差異。上述結(jié)果表明，細(xì)胞/微球/明膠復(fù)合物形式下，PL促進(jìn)DPSCs體內(nèi)形成牙原性組織的效應(yīng)是建立在前期對(duì)細(xì)胞/微球復(fù)合物的預(yù)刺激的基礎(chǔ)上的，當(dāng)PL以包被入Gela