血小板裂解液復(fù)合脂肪來(lái)源干細(xì)胞促進(jìn)腱骨愈合的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、本文從以下幾部分進(jìn)行了論述。
　　第一部分 血小板裂解液對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基中脂肪來(lái)源干細(xì)胞增殖的影響
　　目的:研究血小板裂解液替代胎牛血清對(duì)脂肪來(lái)源干細(xì)胞(ADSC)分離、增殖、免疫表型的影響,為臨床個(gè)體化應(yīng)用PL進(jìn)行損傷修復(fù)提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法:根據(jù)二次離心法制作血小板血漿(PRP),然后通過(guò)凍融法制作血小板裂解液(PL)。進(jìn)行ADSC的分離、培養(yǎng),測(cè)定其免疫表型,使用CCK-8法測(cè)定10％PL組培養(yǎng)、5％PL組培

2、養(yǎng)、10％FBS組培養(yǎng)對(duì)細(xì)胞增殖活性的影響。
　　結(jié)果:對(duì)大鼠血液的二次離心法可以制備出六倍于基礎(chǔ)血小板濃度的PRP,在對(duì)大鼠ADSC進(jìn)行培養(yǎng)時(shí),其免疫表型沒(méi)有發(fā)生突變,CCK-8結(jié)論為10％PL在培養(yǎng)4天時(shí)ADSC增殖活性顯著高于10％FBS,
　　結(jié)論:PL用于培養(yǎng)ADSC時(shí)安全性好,可以在無(wú)血清培養(yǎng)基中應(yīng)用;10％PL培養(yǎng)ADSC時(shí),具有顯著促進(jìn)增殖的優(yōu)點(diǎn),而ADSC的免疫表型沒(méi)有因?yàn)镻L的存在而發(fā)現(xiàn)突變。
　　

3、第二部分 血小板裂解液對(duì)脂肪來(lái)源干細(xì)胞遷移及成軟骨分化的影響
　　目的:評(píng)估血小板裂解液對(duì)ADSC遷移的影響,驗(yàn)證PL在體外對(duì)ADSC的募集作用。研究PL在ADSC成軟骨分化時(shí)的作用,為將來(lái)體內(nèi)應(yīng)用ADSC促進(jìn)腱骨愈合提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。
　　方法:使用Transwell法對(duì)各種濃度的PL進(jìn)行遷移實(shí)驗(yàn),10％FBS作為對(duì)照組,然后分三組:空白對(duì)照組,TGFB3組,PL+TGFB3組分別進(jìn)行ADSC的成軟骨誘導(dǎo)培養(yǎng)。使用阿里新藍(lán)染

4、色測(cè)定檢測(cè)細(xì)胞分泌的蛋白聚糖含量,同時(shí)行 II型膠原免疫熒光檢測(cè)確定其表達(dá),在各個(gè)時(shí)間段行qPCR檢測(cè)II型膠原mRNA表達(dá),在4w時(shí)行OCN的mRNA表達(dá)。
　　結(jié)果:在48h后,可見各濃度PL組有數(shù)量不一的ADSC附著與Transwell纖維膜,5％PL組細(xì)胞遷移能力顯著大于其它各組。成軟骨誘導(dǎo)后阿里新藍(lán)染色見PL+TGFB3組和TGFB3組均勻藍(lán)染,II型膠原免疫組化提示2w及3w時(shí)對(duì)照組無(wú)染色,而TGFB3組在2w及3w時(shí)

5、均有II型膠原染色,PL+TGFB3組在2w和3w時(shí)染色豐富。qPCR檢測(cè)提示對(duì)照組與TGFB3或者TGFB3+5％PL相比,mRNA表達(dá)量要小,2w,3w,4w的P值小于0.001,有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。TGFB誘導(dǎo)與TGFB3+5％PL誘導(dǎo),2w時(shí)P<0.05,3w時(shí)P<0.001,4w時(shí)P<0.01,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,后者mRNA表達(dá)量大于TGFB3誘導(dǎo)組。OCN的mRNA無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。
　　結(jié)論:PL對(duì)ADSC的促進(jìn)遷移作用有濃度依

6、賴,5％PL對(duì)ADSC具有較強(qiáng)的促遷移作用,特定環(huán)境下能促進(jìn)軟骨定向分化,其作用優(yōu)于單純使用 TGFB3,且不會(huì)發(fā)生成骨分化。
　　第三部分 血小板裂解液復(fù)合脂肪來(lái)源干細(xì)胞對(duì)大鼠跟腱腱骨愈合界面的影響
　　目的:探討5％PL復(fù)合 ADSC對(duì)腱骨結(jié)合處的愈合影響,觀察其是否能促進(jìn)纖維軟骨形成,從而從組織學(xué)以及生物力學(xué)方面改善腱骨愈合質(zhì)量。
　　方法:建立大鼠跟腱腱骨愈合模型,清理跟腱止點(diǎn)后分三組,假手術(shù)組(G1), AD

7、SC組(G2),ADSC+％PL組(G3),分別進(jìn)行治療。然后使用HE染色、Masson染色以及阿利新藍(lán)染色進(jìn)行組織學(xué)觀察,在2w、4w、6w時(shí)分別提取腱骨組織,進(jìn)行qPCR檢測(cè)II型膠原含量。并在2w、4w、6w時(shí)測(cè)定生物力學(xué)變化。
　　結(jié)果:HE染色見G1組6w時(shí)止點(diǎn)處為Sharpy纖維,而G2組6w時(shí)形成潮線, G3組4w時(shí)有潮線形成,6w時(shí)可見典型四層結(jié)構(gòu)止點(diǎn)。Masson染色見6w時(shí)G1組纖維組織疏松紊亂,膠原纖維波浪樣

8、,雜亂排列。G2組纖維組織排列較好,膠原纖維邊界清晰。而G3組膠原纖維整齊排列,鈣化軟骨與纖維軟骨結(jié)合緊密。行阿利新藍(lán)染色,G1組6w可見止點(diǎn)愈合,軟骨細(xì)胞周圍有藍(lán)染,鈣化軟骨處有鈣質(zhì)沉積, G2組可見軟骨周圍藍(lán)染較多,軟骨細(xì)胞橢圓形,而G3組軟骨細(xì)胞周圍藍(lán)染較深,說(shuō)明蛋白聚糖含量豐富。各圖像藍(lán)染值統(tǒng)計(jì)學(xué)分析示G3顯著高于其它兩組。qPCR檢測(cè)在各時(shí)間段,G1組II型膠原mRNA表達(dá)量均顯著小于G2組和G3組,在2w時(shí)G2組II型膠原m

9、RNA表達(dá)量與G3組相似,但是4w和6w時(shí)均顯著小于G3組。生物力學(xué)檢測(cè)2w時(shí)G1組的最大拉力載荷最低,與正常腱骨組織相比有顯著性差異,而同時(shí)G2組和G3組比G1顯著增加。但此時(shí)G2組和G3組的最大拉力載荷與正常腱骨組織相比均顯著下降。各組的最大拉力載荷隨時(shí)間而增加。6w時(shí)G2和G3組的最大拉力載荷顯著大于G1。同時(shí)在6w時(shí),G3組的最大拉力載荷顯著大于正常腱骨組織。
　　結(jié)論:PL復(fù)合ADSC時(shí),促進(jìn)ADSC向軟骨細(xì)胞分化,同時(shí)