KGN聯(lián)合純富血小板血漿促進腱骨愈合和纖維軟骨再生的實驗研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 驗證KGN促進肌腱干細胞成軟骨分化的能力
　　目的:體外實驗驗證KGN促進肌腱干細胞向軟骨分化的能力，檢驗體內(nèi)應用KGN促進腱骨愈合研究的可行性，為隨后實驗提供理論基礎。
　　方法:采用膠原酶和中性酶消化法獲取原代肌腱干細胞進行培養(yǎng)，采用單細胞培養(yǎng)法提純肌腱干細胞。然后通過免疫熒光和流式細胞術檢測細胞表面標志物以鑒定所提取細胞是否是肌腱干細胞。然采用不同濃度的KGN處理肌

2、腱干細胞;使用CCK-8方法檢測KGN對于肌腱干細胞的促增殖效應;使用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應方法檢測KGN對于肌腱干細胞的促分化效應。
　　結果:采用膠原酶和中性酶消化法以及單細胞培養(yǎng)技術，并經(jīng)過免疫熒光和流式細胞術鑒定結果表明以上方法可以獲取純度較高的原代肌腱干細胞。通過CCK-8方法檢測的增殖實驗結果表明不同KGN濃度（1nM，10nM，100nM，1μM，10μM）的實驗組中細胞增殖速度并未見明顯差異，并且與空白對照組無明顯差

3、異，這表明KGN對肌腱干細胞的促增殖能力不明顯。通過逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應方法檢測不同濃度KGN處理后肌腱干細胞中軟骨分化相關的三個標志物(Col-2，Sox-9和Aggrecan)均有不同程度的升高，而且升高程度與KGN濃度正相關，這也表明KGN促進肌腱干細胞成軟骨分化能力突出。
　　結論:我們采用的肌腱干細胞提取和鑒定方法較為成熟，可以獲取純度較高的肌腱干細胞。KGN無明顯促進肌腱干細胞增殖的能力，但KGN誘導肌腱干細胞成軟骨分

4、化作用明顯。通過對于KGN的體外實驗研究和驗證結果表明KGN對于肌腱干細胞的作用符合我們預期，適合應用于腱骨愈合的體內(nèi)實驗研究，因而可將KGN用于下一步的體內(nèi)實驗。
　　第二部分 L-PRP與P-PRP對肌腱干細胞的不同細胞學作用
　　目的:以肌腱干細胞作為細胞研究對象，研究兩種不同的富血小板血漿血漿(P-PRP(純富血小板血漿)和L-PRP（富含白細胞血小板血漿））對肌腱干細胞的合成，分解代謝水平以及炎癥反應的同作用，最終

5、獲得L-PRP與P-PRP的不同細胞學作用，并選出其中更有利于組織修復的一種PRP用于隨后的動物實驗;聯(lián)合KGN并作為其載體應用于腱骨愈合的實驗研究中。
　　方法:使用高速短時間的二次離心法獲取P-PRP和L-PRP，將獲得的兩種PRP調(diào)整至相同的血小板濃度。采用與第一部分相同的方法制取和鑒定肌腱干細胞。使用Transwell系統(tǒng)對肌腱干細胞進行體外培養(yǎng)，細胞置于下層，P-PRP或L-PRP放入上層。使用CCK-8進行細胞增殖實驗

6、檢測L-PRP和P-PRP在2％，5％，10％和20％四種不同濃度下對肌腱干細胞的增殖作用。另一部分細胞連續(xù)培養(yǎng)14天，通過光鏡不斷監(jiān)測細胞形態(tài)，并收集細胞培養(yǎng)液上清和細胞通過RT-PCR、Western Blot、細胞免疫熒光染色以及ELISA等手段檢測不同處理后細胞的合成代謝、分解代謝以及炎癥狀態(tài)。
　　結果:我們采用的PRP制取方法可以穩(wěn)定的獲取3倍濃度的P-PRP和L-PRP。細胞增殖實驗結果表明P-PRP和L-PRP均可

7、明顯促進肌腱干細胞增殖，并且與劑量相關，在10％的濃度時促增殖效果最佳，而濃度若繼續(xù)升高促增殖能力逐漸下降。兩種PRP均可誘導肌腱干細胞成肌腱細胞分化并能激活肌腱細胞。但是兩種PRP在很多效果上還存在差異。L-PRP可促進肌腱干細胞處于更高的分解代謝和炎癥狀態(tài);它的作用可以提高分解代謝相關因子MMP-1和MMP-13以及炎癥因子IL-1β，IL-6，TNF-α和PGE2的表達。想法P-PRP這主要提高合成代謝相關因子的表達比如COL-1

8、，COL-3以及α-SMA。
　　結論:這些結果表明L-PRP與P-PRP的細胞學作用的確存在差異。因此PRP類型的不同（特別是是否富含白細胞）很可能是影響PRP療效導致臨床結果不一致的關鍵因素。由于腱骨愈合的關鍵是促進纖維軟骨組織的修復和再生，因此我們選擇促進組織愈合再生方面能力更優(yōu)的P-PRP作為KGN的載體，應用于隨后的動物實驗中，檢測KGN聯(lián)合P-PRP促進腱骨愈合的效果。
　　第三部分 KGN聯(lián)合P-PRP促進腱骨

9、愈合和纖維軟骨再生的體內(nèi)
　　目的:探討KGN聯(lián)合P-PRP膠對纖維軟骨再生以及腱骨連接愈合的作用。
　　方法:按照第二部分方法制取P-PRP，再與KGN粉末按照預先設計的濃度進行混合。采用HPLC（高效液相色譜法）檢測KGN在P-PRP膠中的釋放情況。建立大鼠腱骨隧道愈合模型。體內(nèi)實驗總共51只大鼠，隨機分為三組進行處理:組1向骨隧道中同時注射KGN+PRP混合液50μl+牛凝血酶5μl;組2向骨隧道中注射PRP混合液50

10、μl+牛凝血酶5μl;組3向骨隧道中注射生理鹽水50μl+牛凝血酶5μl。同時組2與組3的溶液中含有與組1溶液中相同濃度的二甲亞砜。于術后第4周，8周，12周取組織標本進行組織學檢測（H&E，Safranin O+Fastgreen，IHC，IF），每次每組3只。于第8周獲取標本進行生物力學檢測，每組8只。
　　結果:KGN在PRP膠中的釋放實驗表明KGN釋放可持續(xù)4天，在最開始的4小時釋放速度最快，4-48小時釋放速度逐漸下降直

11、至平臺期。H&E和SafraninO+Fastgreen染色結果表明KGN聯(lián)合PRP膠可以明顯促進腱骨連接處的軟骨生成，免疫染色結果顯示再生的軟骨高表達Col-1和Col-2，說明再生軟骨為纖維軟骨。生物力學實驗結果也表明KGN聯(lián)合PRP膠組可以明顯提升腱骨連接處的機械性能。并且我們還發(fā)現(xiàn)單獨應用PRP膠并不能有效的促進腱骨界面的軟骨再生。
　　結論:KGN聯(lián)合PRP凝膠可誘導腱骨連接界面的纖維軟骨再生進而促進腱骨隧道愈合;單獨施